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鼠 疫

一、学习要求

掌握鼠疫的传染源、传播途径、人群易感性，掌握鼠疫的诊断方法和各种预防措施。熟悉鼠疫的基本概念及病原学特征，鼠疫的临床分型及各自的临床特征和治疗原则。了解鼠疫的自然疫源地分型。

二、主要内容

[定义]

鼠疫是由鼠疫杆菌引起的一种烈性传染病。以鼠蚤为媒介而传播，常流行于啮齿类动物，是典型的自然疫源性传染病。鼠疫传染性强、病死率高。被列为我国法定甲类传染病之首，也是

国际检疫传染病。

[病原学]

鼠疫杆菌属于长杆菌科耶尔森菌属。鼠疫杆菌呈革兰氏染色阴性，无芽胞和鞭毛，无动力，有荚膜，用吕氏美兰染色时，菌体两端呈浓染。

鼠疫杆菌在有氧条件下生长良好，最适宜的温度为28～30"C，最适PH值为6．9～7．2。在琼脂培养基上经16～20小时培养后，在显微镜下可直接观察到碎玻璃样的小菌落生长。24小时后，形成肉眼可见的灰白色或淡青色中间隆起、半透明伴有透明花边的小菌落。

鼠疫杆菌对热和消毒剂敏感，70～80~C下10分钟死亡，100℃时1分钟死亡。0．1％的升汞中数秒钟即可死亡，5％石炭酸或5％来苏液3—5分钟死亡。鼠疫杆菌不耐热但耐寒，在一30℃低温下仍可较长时间存活。

鼠疫杆菌对抗菌素中的链霉素、金霉素、四环素、氯霉素等敏感，但对青霉素不敏感。

[流行病学)

(一)动物鼠疫流行病学

1. 宿主 根据啮齿动物在疫源地所起作用的不同，可将鼠疫杆菌的贮存宿主分为主要宿主和次要宿主。

(1)主要宿主：其特征为：①是疫源地的优势种，数量稳定、密度较高；②种群分布广，呈岛状或带状连续性分布；③具有适于寄生蚤生存的结构复杂的洞穴和稳定的洞内小气候，其寄生蚤具有传播鼠疫杆菌的能力；④具有冬眠或隐性带菌能力，病原体、媒介和宿主间形成相互适应关系。

(2)次要宿主：虽然可以自然感染鼠疫杆菌，但却不能长期保存鼠疫杆菌，对鼠疫自然疫源地的维持只起辅助作用。

(3)多宿主疫源地：在同一自然疫源地中可以同时存在两个宿主，病原体同时适应两个宿主。

2．传播媒介 鼠疫杆菌的主要传播媒介是跳蚤，在自然条件下能染菌者约百余种，一般主要传播媒介是主要宿主的主要寄生蚤。

3．宿主密度、蚤指数与鼠间鼠疫 宿主密度和媒介蚤指数不仅反映鼠、蚤本身的数量，而且也反映动物鼠疫流行的可能性和流行强度。

4．动物鼠疫流行过程 通常能见到流行过程的三个阶段：第一阶段多发生在动物鼠疫流行初期，主要表现为宿主动物急性死亡，在疫源地内可见到大量死鼠，这一阶段通常持续2～9周，此阶段较容易从死亡动物体内分离到鼠疫杆菌。第二阶段流行强度趋于缓和，宿主动物的感染率有所下降，染疫动物病程迁延，此阶段游离蚤增多，容易从蚤体分离到鼠疫杆菌。第三阶段为动物鼠疫流行的后期，在此阶段，动物感染率急剧下降。在疫源地内很难发现死鼠，但蚤的带菌率仍然较高，宿主动物鼠疫

抗体阳性率及滴度都有所增高。

5．鼠疫自然疫源地分型 按照宿主的生物学特征，可分成下列四种类型。①旱獭疫源地：天山旱獭、长尾旱獭、喜马拉雅旱獭和西伯利亚旱獭等数种，各有其一定的分布地区。②黄鼠疫源地：黄鼠可将鼠疫病原体传播给家鼠，家鼠再传播给人，从而造成疫源地内人间鼠疫的流行。③砂土鼠疫源地：砂土鼠疫源地内的鼠疫流行强度较缓弱，但持续时间较长，可终年不息，呈慢性表现。其传播方式与黄鼠疫源地同。④家鼠疫源地：此类疫源地内鼠疫流行猛烈，流行时室内可发现大量死鼠，人类鼠疫的直接传染源大多来自褐家鼠。

(二)人间鼠疫流行病学

1. 传染源 啮齿类动物中的旱獭、黄鼠、砂土鼠、家鼠等是最主要的传染源。自然界对鼠疫易感的啮齿类动物多达几百种，一般分为主要保菌鼠和次要保菌鼠两类。主要保菌鼠包括黄鼠、长爪砂土鼠、旱獭等．此类传染源意义最大。次要保菌鼠如仓鼠、鼷鼠、白松鼠、鸣声鼠、小田鼠及家鼠等，虽也对鼠疫易感，但不一定保存有传播力较强的体外寄生蚤。其它如猫、野兔、骆驼、狐狸等也是自然界中鼠疫杆菌的保存宿主，可作为本病的传染源，而马、牛等家畜对鼠疫杆菌不易感。

病人作为传染源有4种临床类型，其中包括腺鼠疫、肺鼠疫、败血型鼠疫和其他型，不同临床型作为传染源的意义不同。

鼠疫存在有隐性感染及带菌现象，隐性感染者和带菌者也可作为传染源传播鼠疫。

2．传播途径 主要经媒介生物传播，另外还可通过空气飞沫及接触进行传播。

(1)经媒介生物传播：其传播媒介主要是蚤类，尤以开皇客蚤最为重要，人类的腺鼠疫多数都是通过该蚤传播的。此外尚有100余种蚤类对鼠疫有传播作用，其中主要有黄鼠蚤、二齿新蚤、光亮额蚤、柯氏沙鼠蚤、普氏新蚤、稀有纤蚤、光头角蚤、谢氏山蚤、斧形丽蚤等。

(2)经空气飞沫传播：肺鼠疫病人咳出的飞沫中含有大量鼠疫杆菌，人通过吸入含有鼠疫杆菌的飞沫可直接患肺鼠疫。

(3)接触传播：多与职业有关，如野外猎取旱獭、黄鼠、野兔后剥皮毛时或皮毛加工等过程中，病原体能经破损的皮肤或粘膜侵人人体，造成鼠疫传播。

3．人群易感性 人对鼠疫杆菌普遍易感，微量感染即可能发病。病后可获得较持久的免疫力。接受鼠疫菌苗的预防接种后，可使人群易感性降低。

4．流行特征

(1)地区分布：亚洲的中国、印度、缅甸、尼泊尔、越南、伊朗、蒙古、俄罗斯的远东地区；非洲的肯尼亚、乌干达；北美洲的美国、墨西哥；拉丁美洲的巴西、玻利维亚、秘鲁等皆存在鼠疫自然疫源地，并常有鼠间鼠疫流行。

(2)季节分布：鼠间鼠疫发生的季节因宿主而不同。以黄鼠鼠疫为例，黄鼠三月中旬开始出蛰，四月份交尾，七、八月份幼鼠分居期间即出现流行高峰，至十月黄鼠冬眠，流行即告停息。此系冬眠动物鼠疫流行的规律。家鼠、砂土鼠等非冬眠动物引起的鼠疫，则一年各月份均可发生。

(3)人群分布：鼠疫的发病率及病死率一般五年龄、性别差异。不同人群发病率的高低主要取决于与传染源接触的机会。

[临床症状]

潜伏期短，腺鼠疫2～5天，原发性鼠疫数小时到3天，预防接种者可达9～12天。

起病急骤，畏寒发热，体温迅速升至39～40℃，伴恶心呕吐、头痛及四肢痛．颜面潮红、结膜充血、皮肤黏膜出血等。严重者可出现意识模糊、言语不清、步态蹒跚、腔道出血、血压下降和全身衰竭等。临床分有腺鼠疫、肺鼠疫、败血症型和其他类型鼠疫等，其特征如下：

1. 腺鼠疫 最常见，好发部位依次为腹股沟(约70％)、腋下(约20％)和颈部(约10％)，多为单侧。病初即有淋巴结肿大且发展迅速，淋巴结及周围组织显著红肿热痛，以病后2～3天为最重。若治疗及时，淋巴肿可逐渐消退，治疗不及时，1周后淋巴结很快化脓、破溃，常可发展为败血症或肺鼠疫。

2．肺鼠疫 可原发或继发。原发肺鼠疫起病急，寒战高热、胸痛、呼吸窘迫、发绀、咳嗽、咳痰，痰为黏液或血性泡沫。肺部仅可闻及散在的湿哕音或轻微的胸膜摩擦音。X线检查呈支气管肺炎改变。

3．败血症鼠疫 最为凶险。原发很少，多继发于腺鼠疫或肺鼠疫。起病急骤，寒战高热，全身严重毒血症症状，血压下降，谵妄或昏迷，进而发生感染性休克、DIC及广泛皮肤出血和坏死，病死率极高。

4．其他类型 如：皮肤鼠疫、肠鼠疫、眼鼠疫、脑膜型鼠疫、扁桃体鼠疫等。

[诊断]

1．流行病学资料 起病前10日曾到过鼠疫流行区或与患病动物或病人有接触史。

2．临床表现 有下列临床表现者，应怀疑鼠疫：①起病急骤，有严重毒血症状及出血倾向，迅速虚脱。②呼吸困难，咳嗽，胸痛，血性痰。③急性淋巴结炎，局部剧烈疼痛，采取强迫体位。

3．实验室诊断

(1)细菌学检查：①从宿主动物的脾、肝、肺等脏器取样，或取患者的淋巴结穿刺液、脓、痰、血液和脑脊液等，用血琼脂培养基或肉汤培养基均可分离出鼠疫耶尔森杆菌。②将上述所取标本材料，用生理盐水调成乳剂，注射于豚鼠和小鼠的腹腔，24—72小时内死亡，解剖做细菌学检查。

(2)血清学检查：①间接血凝法(PHA)：是以鼠疫杆菌的FI抗原检测血中n抗体，此种方法常用于鼠疫的回顾性诊断和流行病学监测。②酶联免疫吸附试验(ELISA)：用于检测n抗体和FI抗原，此方法较PHA敏感，适于进行鼠疫流行病学调查工作。③放射免疫沉淀试验(RIP)：可检测出血中微量的n抗体，常用于追溯诊断及免疫学研究。④荧光抗体法(FA)：用荧光标记的特异性抗血清检测可疑标本，可对鼠疫感染做出快速诊断。

(3)分子生物学检测：DNA探针和聚合酶链反应(PCR)不但能进行快速诊断，而且具有较高的敏感性和特异性。

[治疗原则]

应早发现、早诊断、早隔离、早治疗及疫区早处理

1. 一般治疗 急性期绝对卧床，严格隔离，补充足够液体量。做好患者分泌物、排泄物的消毒处理。

2．病原治疗 早期足量应用有效抗生素是降低病死率的关键。联合应用庆大霉素、四环素、氯霉素、链霉素等抗生素，可以提高疗效。

3．对症治疗 高热病人予以药物或物理降温，局部疼痛及烦躁可予以止痛剂、镇静剂。有严重毒血症患者适当应用糖皮质激素。呼吸困难病人应予吸氧，休克病人应及时抗休克治疗。

4．局部治疗 ①鼠疫淋巴结避免挤压，以避免败血症的发生。脓肿形成可切开排脓，切开时注意严格消毒，避免继发感染，早期在淋巴结周围注射链霉素0．5～1．0g也有一定疗效。②皮肤病灶局部可涂用o．5％链霉素或四环素软膏。③眼鼠疫可用0．25％氯霉素眼液或10％硝酸银滴眼。

[预防措施]

1．经常性预防

(1)消灭鼠疫的根本性措施：拔除鼠疫的自然疫源地是消灭鼠疫的根本性措施，此项措施是通过消灭鼠疫在啮齿类动物间的流行而达到根除鼠疫的目的。

(2)加强国境卫生检疫：在港口、陆路交通口岸及国际通航的机场，针对鼠疫，实施国境卫生检疫。

(3)开展预防接种：在鼠疫流行季节前1～2个月，对疫区居民、参加防疫、进入疫区的医务人员有计划地进行鼠疫菌苗的预防接种。非疫区人员在鼠疫菌苗接种10天后方可进入疫区。

(4)灭蚤及灭鼠：对居民的床、炕、地面等实施灭蚤，对鼠洞、家畜或家禽窝及其他蚤类孳生场所也分别予以灭蚤，以消灭传播媒介。

(5)开展流行病学监测：疾病预防控制部门应不断地监测主要储存宿主的数量变动和体外寄生蚤的消长情况，也应开展经常性的鼠间鼠疫的病原学和血清学监测工作。

2．发生疫情时的紧急措施

(1)疾病预防控制人员、医务人员及有关人员在接到鼠疫疫情后，应于2小时内出发，抵达现场后，进一步核实并了解疫情及发病情况，如确属可疑，应立即确定以病家为中心连同与病家有接触关系的邻居在内的“小隔离圈”和“大隔离圈”，再以“小隔离圈”为中心，将5—10公里半径范围内所有村庄、街道等全部划人“警戒圈”的范围。

(2)在“小隔离圈”内开展工作的所有人员应穿好安全防护服，并用5％来苏液对室内进行彻底的喷雾消毒，小隔离圈内对病家衣物等进行蒸煮消毒并进行灭蚤(特别是鼠洞灭蚤)，消毒灭蚤之后，立即开展灭鼠。

(3)对病人及可疑病人，应从速采样送检，并移至无鼠无蚤之室内或送临时隔离病房治疗，与病人同居的家属也应立即移至无鼠无蚤之室内隔离观察。

(4)所有接触者检疫9天，检疫期间每日检查体温2次，凡发热者投以磺胺嘧啶或四环素作预防性治疗。

(5)在大隔离圈内，应普遍开展鼠疫菌苗接种，开展群众性的灭鼠灭蚤活动。在解除封锁前，所有皮毛、粮食、柴禾及衣物等物品一律不得外运。

(6)对疫情要立即上报，以最快捷的通讯工具向所在的疾病预防控制部门报告。城市不得超过6小时，农村不得超过12小日寸。

(7)按要求封锁局部交通，必要时封锁铁路交通和公路交通。

(8)痊愈和解除隔离的标准：腺鼠疫病人一般在腺肿吸收后，淋巴结内容物检菌连续3日阴性；肺鼠疫病人于症状消失后，痰液每3 W检菌一次，连检6次以上均为阴性；皮肤型鼠疫在创面完全愈合后，检菌3次以上阴性；败血型鼠疫在症状完全消失后检菌3次阴性时，即可解除隔离。所有密切接触者，一律从采取消毒、灭蚤、灭鼠等措施后算起隔离9天。

(9)尸体处理：死于鼠疫患者的尸体原则上应火葬，若火葬确有困难，应于远离居民点和交通要道二公里以外的地方深埋至二米以下。

三、测试题目

(一)单选题

1. 鼠疫是我国法定 传染病。

A甲类 B．乙类 C. 丙类 D. 丁类

2．鼠疫主要以 为媒介而传播。

A蚊虫 B．鼠蚤 C昆虫 D家禽

3．鼠疫的临床分型中， 最为凶险。

A腺鼠疫 B．肺鼠疫 C败血症鼠疫 D其他类型鼠疫

4．在鼠疫的血清学检查中，可对鼠疫感染做出快速诊断的是——

A接血凝法(PHA) B．酶联免疫吸附试验(ELISA)

C放射免疫沉淀试验(RIP) D．荧光抗体法(FA)

5 是消灭鼠疫的根本性措施

A拔除鼠疫的自然疫源地 B预防接种

C．加强国境卫生检疫 D．开展流行病学监测

(二)是非题

1．鼠疫是危害人类最严重的烈性传染病之一。( )

2．鼠疫杆菌对抗菌素中的青霉素很敏感。( )

3．鼠疫杆菌耐热但不耐寒，在一30度低温下即可死亡。( )

4．鼠疫不存在有隐性感染及带菌现象，隐性感染者和带菌者不可作为传染源传播鼠疫。( )

5．鼠疫的发病率及病死率一般无年龄、性别差异。不同人群发病率的高低主要取决于与传染源接触的机会。( )

(三)填空题

． 1. 鼠疫以鼠蚤为媒介而传播，常流行于啮齿类动物，是典型的 传染病。

2．鼠疫主要经媒介生物传播，另外还可通过 及 进行传播。

3．按照宿主的生物学特征，可将鼠疫自然疫源地分成 、 、 和 类型。

4．人对鼠疫杆菌普遍易感，微量感染即可能发病，但是病后可获得较 的免疫力。

5．腺鼠疫的好发部位依次为 、 和

(四)简答题

1．简述鼠疫的概念。

2．鼠疫的主要宿主有哪些特征。

3．简述人间鼠疫的流行病学特征。

4．简述鼠疫的临床分型及特征。

5．简述鼠疫的经常性预防控制措施。

四、参考答案

(一)单选题

1．A 2．B 3．C 4．D 5．A

(二)是非题

1．是 2．非 3．非 4非 5是

(三)填空题

1．自然疫源性 2．空气飞沫、接触

3．旱獭疫源地、黄鼠疫源地、砂土鼠疫源地、家鼠疫源地

4．持久 5．腹股沟、腋下、颈部

(四)简答题

1．鼠疫是由鼠疫杆菌引起的一种烈性传染病。以鼠蚤为媒介而传播，常流行于啮齿类动物，是典型的自然疫源性传染病。鼠疫传染性强、病死率高。被列为我国法定甲类传染病之首，也是国际检疫传染病。

2．主要宿主是疫源地的优势种，对鼠疫杆菌具有一定的感受性并能引起菌血症或败血症，对疫源地形成和鼠疫杆菌的延续起主要作用。其特征为：①是疫源地的优势种，数量稳定、密度较高；②种群分布广，呈岛状或带状连续性分布；③具有适于寄生蚤生存的结构复杂的洞穴和稳定的洞内小气候，其寄生蚤具有传播鼠疫杆菌的能力；④具有冬眠或隐性带菌能力，病原体、媒介和宿主间形成相互适应关系。

3．①传染源包括患病的啮齿类动物，以旱獭、黄鼠、砂土鼠、家鼠等是最主要的动物传染源；病人作为传染源包括腺鼠疫、肺鼠疫、败血型鼠疫和其他型源，但不同临床型作为传染源的意义不同。②传播途径主要经媒介生物传播，另外还可通过空气飞沫及接触进行传播。传播媒介主要是蚤类，尤以开皇客蚤最为重要，人类的腺鼠疫多数都是通过该蚤传播的；肺鼠疫病人咳出的飞沫中含有大量鼠疫杆菌，人通过吸人含有鼠疫杆菌的飞沫可直接患肺鼠疫，能迅速造成人间肺鼠疫的流行；接触传播多与职业有关，如野外猎取旱獭、黄鼠、野兔后剥皮毛时或皮毛加工等过程中，病原体能经破损的皮肤或粘膜侵人人体，造成鼠疫传播。③人群对鼠疫杆菌普遍易感，微量感染即可能发病。病后可获得较持久的免疫力。接受鼠疫菌苗的预防接种后，可使人群易感性降低。④流行特征：鼠疫是自然疫源性传染病，人间鼠疫的地理分布与动物疫源地紧密相联；鼠间鼠疫发生的季节因宿主而不同，源于家鼠鼠疫的人间鼠疫，由于家鼠无冬眠现象，全年皆可发生；鼠疫的发病率及病死率一般无年龄、性别差异，不同人群发病率的高低主要取决于与传染源接触的机会。

4．临床分为腺鼠疫、肺鼠疫、败血症型和其他类型鼠疫等，其特征如下：

(1)腺鼠疫：最常见，好发部位依次为腹股沟(约70％)、腋下(约20％)、和颈部(约10％)，多为单侧。病初即有淋巴结肿大且发展迅速，淋巴结及周围组织显著红肿热痛，以病后2～3天为最重。若治疗及时，淋巴肿可逐渐消退，治疗不及时，1周后淋巴结很快化脓、破溃，常可发展为败血症或肺鼠疫。

(2)肺鼠疫：可原发或继发。原发肺鼠疫起病急，寒战高热、胸痛、呼吸窘迫、发绀、咳嗽、咳痰，痰为黏液或血性泡沫。肺部仅可闻及散在的湿哕音或轻微的胸膜摩擦音。体征与病情严重程度不一致是本病特征之一。X线检查呈支气管肺炎改变。

(3)败血症鼠疫：最为凶险。原发很少，多继发于腺鼠疫或肺鼠疫。起病急骤，寒战高热，全身严重毒血症症状，血压下降，谵妄或昏迷，进而发生感染性休克、DIC及广泛皮肤出血和坏死，病死率极局。

(4)其他类型鼠疫：如：皮肤鼠疫、肠鼠疫、眼鼠疫、脑膜型鼠疫、扁桃体鼠疫等。

5．①消除鼠疫的自然疫源地是消灭鼠疫的根本性措施，因为只要有疫源地的存在，就有可能造成鼠疫流行。②加强国境卫生检疫。③在鼠疫流行季节前1～2个月，对疫区居民、参加防疫、进人疫区的医务人员有计划地进行鼠疫菌苗的预防接种。非疫区人员在鼠疫菌苗接种10天后方可进入疫区。④灭蚤及灭鼠。⑤开展安全猎獭工作。⑥开展流行病学监测和经常性的鼠间鼠疫病原学及血清学监测工作，不断完善预防对策和措施。

乡约

鼠疫血清学检验
一、发展史及重要性       
鼠疫是严重的烈性传染病。50年代以前，鼠疫的诊断主要靠分离病原菌的方法作为依据。但由于鼠疫菌只能在动物鼠疫流行猛烈或动物倒毙时才能分离到。从活动物体内分离的鼠疫菌仅为死动物的5‰。某些因素如被检材料的腐败程度、鼠疫病人取材前是否服用过抗生素、病原菌的毒力等均可不同程度地影响到鼠疫菌的分离。因此，仅靠细菌学的诊断已不能满足鼠疫疫源检索、动物鼠疫调查、鼠疫病人诊断等的需要。
从上世纪20年代，国内外学者就不断地寻找理想的鼠疫血清学诊断方法，以求解决细菌学所不能解决的问题。经过几十年的努力，鼠疫血清学诊断的研究有了迅速的发展，取得了可喜的成果。许多实用有效的血清学检测技术，在鼠疫防治领域内已得到广泛应用。
二、相关的基本知识
1、血清学检验的机理实质就是抗原抗体免疫化学反应。抗原（Antigen Ag）或抗体（Antibody Ab）与其相对应的特异抗体或抗原在一定条件下（适宜的反应介质和温度），可发生免疫化学反应生成特异的抗原—抗体复合物。
2、抗原（Antigen Ag）：能刺激机体免疫系统诱导免疫应答并能与应答产物抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应得物质，分为可溶性抗原和颗粒性抗原。
3、抗体（Antibody Ab）机体的免疫系统受A刺激后，由浆细胞合成分泌的一类能与抗原发生特异性结合的一类球蛋白。是B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质。主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。
4、补体(Complement  C)新鲜血清中存在一种不耐热的成分（56°C 30／灭活），可辅助特异性抗体介导的溶菌或溶细胞作用。
5、F1抗原 ：是鼠疫菌在37度培养下，在菌体周围生长的一层封套物质中的一部分。系多糖蛋白质复合物，是鼠疫菌的特异性性抗原之一。常用于F1抗体的检测。为可溶性抗原。
6、可溶性抗原：指蛋白质、糖蛋白、细菌毒素等.可溶性抗原与抗体反应不能通过肉眼直接观察,所以需要借助载体发生肉眼可见的凝集现象。常用载体有红细胞、胶乳颗粒和炭颗粒。
三、分类
目前,用于鼠疫血清学诊断的检测技术大体上分为二类,一类是检查鼠疫菌抗体的血清学检验，另一类是检查鼠疫菌抗原的血清学检验。
（一）、鼠疫抗体的血清学检验：
1、检查的对象：
⑴、人：细菌分离阴性的疑似鼠疫病人；抗生素特异治疗的恢复期病人或患过鼠疫的康复者；疫区内受过鼠疫菌感染，但未出现临床症状或症状不显者。以上三种情况均取血检查有无鼠疫菌抗体以进行诊断或追溯诊断。
⑵、:动物：疫源地内主要宿主动物；疫源地内其他种类动物（如食肉类、捕食鼠类的动物。特别是狗感染鼠疫后能产生高滴度的鼠疫抗体，利用犬可作为检查鼠疫疫源的指示动物。）
2、主要方法：
间接血球凝集试验
酶联免疫吸附试验
胶体金免疫层析滤纸条
放射免疫沉淀试验
（二）、鼠疫抗原的血清学检查
1.检查对象:
⑴人或动物脏器:对于疑似鼠疫的人和啮齿动物尸体,特别是在脏器腐败无法查到鼠疫菌的情况下,检查有无鼠疫菌抗原的存在,可以做出是否患过鼠疫的诊断,也是快速诊断鼠疫的重要方法之一,对早期判定人、鼠间疫情具有重要意义。
⑵其他疑似被检材料:宿主动物体上寄生的蚤类等传播媒介、洞穴的土壤、猛禽的唾液、被鼠疫菌污染的皮毛、衣服等均可检查有无鼠疫菌抗原，可为追溯传染源，判定疫情等提供依据。
2、主要方法：
反向间接血球凝集试验
酶联免疫吸附试验
胶体金免疫层析滤纸条
放射免疫分析
免疫荧光试验
鼠疫间接血球凝集试验
一、概述
间接红血球凝集试验(IHA)，它是一种敏感性高、特异性强的血清学诊断方法。由于红细胞被动地凝集在一起，故又称为被动血凝试验（PHA)。
1、特点：
a. 敏感性高：可检测出微量抗体；
b. 时间短、快速：在2-3h内可出结果；
c. 特异性好：FI抗原抗体反应特异性高，与假结核血清出现交叉反应不超过
1：5；
d. 诊断制剂制作简单、稳定；抗原致敏血球可冷藏保存1-2年，敏感性和特异性不受影响；
f. 设备简单，不需要特殊设备
2、应用：
a. 疑似鼠疫患者的诊断和追溯诊断；
b. 开展动物鼠疫流行调查和流行规律的调查；
c. 用于实验研究，观察抗体的产生；
d. 对鼠疫菌苗和菌苗免疫效果进行评价等方面。
二、原理
间接红血球凝集试验又称为被动血凝试验，简称间接血凝实验。为了大家理解这个实验，我先介绍几个概念：
凝集反应：在细菌或血球颗粒性抗原悬液中,加入含有特异性抗体的血清和适宜的介质的情况下,使细菌或血球凝集成结块的现象叫凝集反应.存在于血清中的抗体叫凝集素，与凝集素相结合的抗原叫凝集原.凝集反应又分为直接凝集反应和间接凝集反应。
直接凝集：抗原抗体反应过程中，抗原如果是颗粒性的，当与相应的抗体在生理盐水中反应时，颗粒性抗原表面的抗原决定簇与相应的抗体结合并逐步形成肉眼可见的大凝集块，此种反应为直接凝集。
间接凝集：若抗原是水溶性的则只是抗原抗体发生免疫反应，形成抗原-抗体复合物，但此复合物是肉眼不可见的，需加入相应的载体，借助载体的凝集出现可见反应，此种反应称为间接凝集。
间接红血球凝集试验(IHA)原理：将鼠疫菌特异性F1抗原致敏于经单宁酸处理醛化的绵羊红血球上，以检查鼠疫特异性F1抗体的血清学方法。这种反映结果可通过血球凝集表现出来，是一种半定量试验。
三、检查对象
1、人：
a.细菌分离阴性的疑似鼠疫病人；
b.抗生素特异治疗的恢复期病人或患过鼠疫的康复者；
c.疫区内受过鼠疫菌感染，但未出现临床症状或症状不显者。
2、动物：
a.疫源地内主要宿主动物；
b.疫源地内其他种类动物（如食肉类、捕食鼠类的动物）。特别是狗感染鼠疫后能产生高滴度的鼠疫抗体，利用犬可作为检查鼠疫疫源的指示动物。
四、材料采集及处理
1、材料采集：
  ⑴鼠疫患者及疑似鼠疫病人血清的采集：常规无菌操作取静血3-5ml，注入灭菌试管分离血清。
  ⑵动物血清的采集：
①心脏采血：较大的被检动物用此法。将动物固定，在心脏搏动明显处用碘酒和酒精消毒，用灭菌注射器刺入抽取血液3－5ml，注入灭菌中试管，摆成斜面，凝固后直立分离血清。
②股动脉放血：一般啮齿动物用此法。固定动物，消毒腹股沟处皮肤，用灭菌剪刀剪一小口，暴露股动脉，剪断血管，使血液直接流入灭菌中试管，摆成斜面，凝固后直立分离血清。
③滤纸片法：常用于不能采足量血的小型啮齿动物和死亡动物。选用1×7cm的滤纸条，用镊子夹住滤纸条一端，沾取心腔或其他脏器内的全血及渗出液，击伤动物可于伤口采血。标号干燥后保存。用时剪取3.5cm滤纸条（含血清量约0.1ml），加入0.9ml生理盐水，浸泡1h，取上清（相当于血清1：10稀释）备用。
④毛细管采血：适用于小型啮齿动物调查。固定动物，消毒被检动物尾部或足趾，用剪刀剪一切面，挤出血液，选择直径1mm,长6～7cm的灭菌毛细管吸取，一端用火焰或蜡封闭后离心，灭活后，锯取0.65cm长有血清的毛细管（含血清0.005ml），用于微量法血凝试验。
2、.材料处理：
   血清标本应经56℃30分钟灭活，保存在4℃待检。如需长期保存则加入叠氮钠 或1%硫柳汞 。
五、实验用品
1、试剂：
①2.5%F1抗原致敏血球：（有10％冻干血球和10％混悬液血球两种制品。贮存于4℃～8℃内2年内不失效，室温保存至少半年以上。用前以1％健康兔血清盐水稀释成2.5％血球悬液供试管法用。最好当天使用，若延期使用应置冰箱，不宜超过1周。）(a.用细菌凝集效价为1：320的鼠疫全菌免疫血清，血凝滴度应不低于1：40000 。b.与假结核血清交叉滴度应不高于1：5。符合a)、b.）的致敏血球为合格的诊断血球。
②1%正常兔血清盐水：供稀释液用。
③2.5%单宁酸血球：供复查阳性血清使用，与鼠疫FI抗原致敏血球同一批次。
④醛化正常血球:供被检血清非特异性凝集素的吸收处理。
⑤鼠疫F1抗原：供血凝3排复判时抑制试验用(用时以1％兔水稀释成50～100μg/ml作为抑制液)。
○6阳性参考血清。
2、器材：
○1、仪器：冰箱、温箱、离心机等；
○2、玻璃器皿：吸管、试管、烧瓶等；
○3、其他：试管架、吸耳球、加样器、微量血凝板等。
（一次性用品一次性微量血凝板，吸头等要一次性使用，不要重复用。高值用品加样器、离心机等仪器、设备，要爱护，定期对准确性进行检测。）

六、具体操作
（一）、试管法：
1.、将小试管排列在试管架上，标明管号：
a、向第1管内加入0.9ml1%健康兔血清盐水，以后每管各0.5ml；
b、取被检血清0.1ml，加入第1管中，混匀后行倍比稀释，最后1管取0.5ml弃去；
c、再用1ml刻度吸管，向各管滴加2.5%F1抗原致敏血球1滴（0.05ml），振荡混匀血球，置37℃温箱或室温2-3小时观察果；
2、致敏血球敏感性测定一般做15管，疑似材料做6管，如系调查时初筛试验可做2管，即1：10和1：100。
3、试验应设对照：
    空白对照：稀释液0.5ml +2.5%鼠疫FI抗原致敏血球1滴。
    阴性对照：1：20被检血清 0.5ml +2.5%单宁酸血球1滴。
一般现场材料不使用阳性对照，以免混淆结果。
（二）、微量法:
1、具体操作方法是：
   ①每份被检血清在V型孔微量血凝板稀释5孔。标明被检血清编号及孔号。
   ②用移液器向每孔分别加入25μl 稀释液；
   ③在第1孔中加入被检血清25μl，吸排4－6次，充分混匀后，取25μl移至第2孔，充分混匀，依次稀释至最后一孔，弃掉25μl；
   ④分别向各孔内加入1%鼠疫FI抗原致敏血球25μl，振荡混匀。此时从第1孔开始，被检血清的最终稀释度为1：4、1：8、1：16……，以此类推。置37℃温箱2h后观察结果。
2、 每批试验应设对照：
    空白对照：稀释液25μl +1%鼠疫FI抗原致敏血球25μl。
    阴性对照：1：20被检血清25μl +1%单宁酸血球25μl。
七、结果判定
1、红血球不凝集在管底或孔底呈致密的纽扣状，边缘光滑整齐，或呈现1个狭小的圆圈，为阴性结果。
2、红血球在管底或孔底呈不均匀分布，边缘呈翻伞状或不整齐的粗糙型，为阳性结果。  阳性结果又按红血球在管底或孔底部分凝集及边缘粗糙程度划为：
#：呈疏松花团状或凝集物紧密，凝集物布满管底，有明显的折边。
＋＋＋：凝集血球铺满孔底，无折边。
＋＋：血球不完全凝集，在孔底呈整齐的圆圈或点，但圈内外有非常明显的血球凝集。
＋：在孔底形成较小的圆圈或点，在圈外或点外只有很少的血球凝集。
–：血球全部沉积在孔的底部，呈整齐的小珠状或圆圈。
3、结果判定：
     国内以‘++’为血凝试验阳性。被检血清出现阳性结果时要进行复判，以证明是否是特异性凝集。
4、被检血清出现阳性结果时为什么要复判？
    在间接血凝试验中，因为有的被检材料含有非特异性物质、受污染或试验时所用器材不洁及试剂不纯等因素的影响，可使F1抗原致敏血球出现非特异性凝集，出现假阳性结果。因此，血凝试验出现阳性时必须进行复判。

乡约

八、复判方法：血凝抑制试验
1、原理：
是用一定量的鼠特异性F1抗原中和被检血清中鼠疫特异性F1抗体。若被检血清中含有鼠疫特异性F1抗体时，则可被F1抗原中和，呈肉眼不可见的中和反应。这种被中和的血清大部分或全部丧失了与鼠疫特异性F1抗原致敏血球发生凝集的能力，起凝集现象大部分或全部被抑制。这种现象称为血凝抑制阳性，证明被检血清中真正含有鼠疫特异性F1抗体；反之为阴性，说明是非特异性凝集。
2、复判的方法：
    两排复试：将被检血清平行倍比稀释两列，进行血凝抑制(第一排)、血凝(第二排) 两列试验 。
    复判前须将被检血清进行吸收：用正常醛化血球吸收非特异性凝集素。其方法是：1份被检血清加4份2.5%正常醛化血球（微量法：1%正常醛化血球），混匀后室温作用15~30分，1500转5分钟离心后取上清供试验用（此时被检血清为5倍稀释）。
⑴、试管法血凝试验的复判
1、操作步骤： 取小试管两列。
  A、第一列第一管加1％健康兔血清盐水0.9ml，其余各管加0.5ml ，为血凝抑制列。第二列各管内均加1％健康兔血清盐水0.25ml，为血凝列；
  B、于第一管内加入0.1ml被检血清，混匀后，吸取0.75ml至第一列第二管0.5ml、第二列第一管0.25ml。如此稀释至第最后1管，弃去0.5ml；
  C、于第1排各管内加入0.25ml鼠疫FI抗原抑制液（1％兔水稀释50～100μg/ml作为抑制液)，均匀后37 ℃作用10～15分钟；
  D、再向第1、第2列各管内加入2.5％鼠疫F1抗原致敏血球1滴，(此时两排稀释度均自1:20开始、如果被检血清吸收处理后则为5倍稀释，稀释度均自1：100开始),置37℃2h或室温2～3h观察结果。
2、同时设下列对照
空白对照：稀释液0.5ml +2.5%鼠疫FI抗原致敏血球0.05ml 。
阴性对照：1：20被检血清0.5ml + 2.5% 单宁酸血球0.05ml 。
阳性对照：阳性参考血清0.5ml + 2.5% 鼠疫FI抗原致敏血球0.05ml 。
⑵、 微量法血凝试验：
1、复判操作步骤：
   ①、将初筛阳性的血清稀释两列，第一列为血凝抑制试验列，第二列为血凝试验列。标明被检血清编号及孔号。
   ②、第一列每孔内加抑制剂25μl，第二列每孔内加稀释剂25μl。
   ③、分别取被检血清25μl加入各列的第一孔内，吸排混匀4－6次，吸取25μl移入相应列的第二孔内，混匀。依此类推稀释至最后一孔，吸出25μl弃入消毒液中。置37℃温箱10－15分钟。
   ④、在第一、二列各孔中，用移液器加入1%的鼠疫FI抗原致敏血球液25μl。振荡混匀，置37℃2小时后观察结果。至此，每列第1孔的稀释度为1：20。
2、同时设下列对照各1孔。
空白对照：稀释液25μl +1%鼠疫FI抗原致敏血球25μl。
阴性对照：1：20被检血清25μl +1%单宁酸血球25μl。
阳性对照：阳性参考血清25μl＋1%鼠疫FI抗原致敏血球25μl。
（3）、结果判定：方法同初筛试验结果判定
（4）、最终结果：
空白对照、阴性对照孔不应呈现凝集，阳性对照成立。当血凝抑制列呈“++”凝集的孔比血凝试验列少2孔以上，判定为特异性凝集。阳性血清最终效价为凝集排呈现“++”的最高稀释度。
后经两排复判，试管法血凝滴度在1：20，微量法血凝滴度在1：16以上时，即判为血凝阳性。填写“鼠疫血凝阳性”表逐级上报，并将被检材料立即送上级业务单位复查
九、影响因素
1、试剂的质量：致敏血球及稀释液等。
2、器材的洁净度：要洗净。
3、人为因素:不认真。
4、试验条件: 37℃2小时。
5、标本采集和血清分离:灭活及吸附
十、注意事项
1、试验用器材、器具要清洗要干净；使用过的，要洗净后再用蒸馏水冲洗1—2次，（防止残留的消毒液、洗液及阳性材料造成假阳性）干烤或高压处理。
2、微量血凝试验要使用一次性的“V”型微量血凝板。使用移液器加试剂。吸头也要使用一次性的，应与移液器配套。滴加各种试剂要准确，防止交叉污染。
3、试剂要注意保存条件和有效期，使用前应进行一次效价测定。血凝用各种试剂最好现用现配，4℃保存不易超过1周，室温不应超过2天。试剂污染是非特异性凝集的重要因素之一。
4、操作人员应熟练掌握技术，专心操作，操作过程中不得闲谈，动作要轻柔、准确。
5、被检血清、样品试验前应做灭活处理。灭活可消除大约80%的非特异反应。
6、每份标本要记录清楚，不能混淆。
7、注意血凝试验出现假阳性或非特异性凝集。多数情况下是由于所用器械不洁净、试剂污染造成的，如器械残留消毒剂或洗涤液中其他杂质成份，都会直接影响血凝结果。为避免发生非特异性凝集，首先要保证血凝试验所用器械清洁、干燥、无菌，尽量使用一次性用品。
•1∶1000肥皂水溶液可使血清产生非特异性凝集，来苏儿浓度为1∶5000时可使正常血清产生假阳性反应。
•用水质PH 8.0以上或含杂质较多的水洗涤血凝用品，可产生非特异性凝集。
•被检血清被杂菌污染和兔血清盐水对血凝试验的影响：据报导，每毫升兔血清盐水内含5000万以上杂菌，每毫升被检血清含5亿以上杂菌，血凝试验均可能产生非特异性凝集。（因此被检血清一定要灭活或吸收处理）。
试管法与微量法的不同？
1、在实际应用中两者所限阳性率无明显差异，但试管法的血凝滴度比微量法高5-10倍。
2、微量法结果清晰，对照稳定，器材节约，结果出现快，便于野外应用。
3、微量法要求器材的洁净度与试剂的纯度高，操作要精确和规范，在野外尤为注意。
反向间接血球凝集试验
一、概论
1、反向血球凝集试验：是相对于间接血球凝集试验而言。将已知鼠疫FI抗体致敏到经单宁酸处理的绵羊血球上，以检测样品中的鼠疫FI抗原是否存在，此方法称为反向血球凝集试验。
2、反向血凝试验多用于：分离鼠疫菌困难的情况下；对疑似鼠疫病人的诊断、动物鼠疫的判定。
3、特点 ：快速、敏感，有较高特异性,可检查活菌,死菌和可溶性抗原,可在污染材料中发现鼠疫菌抗原物质。
二、原理
是将鼠疫特异性抗体致敏到绵羊红血球上,以检查鼠疫菌特异性抗原的血清学方法.当这种抗体在适宜的介质中与相应的抗原相遇时,就会发生免疫化学反应,然后通过血球凝集现象表现出来.
三、材料收集与处理
1、动物材料：以无菌条件取动物肝脾3-5克，置于3-5毫升的1%升汞盐水， 制成1：10的材料；绞碎，3000转离心10分钟，取上清液备用。
2、腐败材料：取骨髓，黄鼠一般用0.5毫升 1%健康兔血清盐水冲洗，制成1：10的材料。
3、动物巢穴、排泄物、猛禽吐物、昆虫等材料。
四、试剂与器材
1、试剂
（1）稀释液：含1%正常兔血清的生理盐水。
（2）鼠疫FI抗体致敏血球。
（3）单宁酸血球：与鼠疫FI抗体致敏血球同一批次。
（4）抑制剂为1：100稀释的鼠疫免疫血清，含鼠疫FI抗体。
（5）阳性对照血清：
2、器材同上
五、具体步骤
（1）、试管法：
1、具体操作方法是：
a、将洁净的小试管10支排列在试管架上，第1管加0.9ml，其余各管加0.5ml1%健康兔血清盐水；
b、再将被检材料0.1ml加入第1管内，依次作倍比稀释，最后1管弃去0.5ml。
c、每管加入1滴2.5%鼠疫抗体致敏血球，振荡混匀，置37℃或室温2—3小时观察结果。
2、同时作如下对照:
空白对照：稀释液0.5ml +2.5%鼠疫FI抗体致敏血球1滴。
    阴性对照：被检液0.5ml +2.5%单宁酸血球1滴。
（2）、微量法：
1、初筛试验操作步骤：
a、每份被检液在V型孔微量血凝板稀释5孔。标明被检标本编号及孔号。
b、用移液器向每孔分别加入25μl 稀释液。
c、在第1孔中加入被检液25μl，吸排4－6次，充分混匀后，取25μl移至第2孔，充分混匀，依次稀释至最后一孔，弃掉25μl。
d、分别在各孔内加入1%鼠疫FI抗体致敏血球25μl，振荡混匀。置37℃温箱2h后观察结果。
2、 每批试验应设对照：
    空白对照：稀释液25μl +1%鼠疫FI抗体致敏血球25μl。
    阴性对照：被检液25μl +1%单宁酸血球25μl。
六、结果判定
1、红血球不凝集在管底或孔底呈致密的纽扣状，边缘光滑整齐，或呈现1个狭小的圆圈，为阴性结果。
2、红血球在管底或孔底呈不均匀分布，边缘呈翻伞状或不整齐的粗糙型，为阳性结果。  阳性结果又按红血球在管底或孔底部分凝集及边缘粗糙程度划为：
＃：凝集紧密，凝集物布满管底，有明显折边，抗体过量时， 凝集呈疏松花圈状。
＋＋＋：凝集血球铺满孔底，无折边。
＋＋：血球不完全凝集，在孔底呈整齐的圆圈或点，但圈内外或点外有非常明显的血球凝集。
＋：在孔底形成较小的圆圈或点，在圈外或点外只有很少的血球凝集。
  –：血球全部沉积在V型孔的底部，呈整齐的小珠状。
结果判定：以“++”凝集为阳性界限；该试管稀释倍数为反向血凝滴度。被检液出现阳性结果时要进行复判，以证明是否是特异性凝集
七、复判方法：反向血凝抑制试验
1、原理：
     利用特异性抗体中和血清中特异性抗原,则再次加入抗体致敏血球时不能再和相应抗原作用,红血球不呈现凝集现象,反之,若产生红血球凝集则说明血清中有非特异性物质存在。
2、复判的方法：
（1）、试管法复判：将被检液倍比平行稀释两排。第一排为反向血凝抑制试验，第二排为反向血凝试验
a、第一排第一管加0.8ml，其余各管加0.5ml 1％健康兔血清盐水；第二排各管内均加0.25ml1％健康兔血清盐水；
b、于第一排第一管内加入0.2ml被检抗原（稀释度为1:50），混匀后，吸取0.75ml至第一排第二管0.5ml、第二排第一管0.25ml。如此稀释至第10管；
c、于第1排各管内加入1:100稀释的抗鼠疫血清0.25ml，室温作用10～15分钟；
d、再向第1、第2排各管内加入2.5％鼠疫抗体致敏血球1滴，(此时两排稀释度均自1:100开始),置37℃2h或室温2～3h观察结果。血清稀释度为：1：100 200  400  800  1600  3600 …
e 、同时设下列对照：
空白对照：稀释液0.5ml +2.5%鼠疫FI抗体致敏血球0.05ml 。
阴性对照：被检液0.5ml + 2.5% 单宁酸血球0.05ml 。
阳性对照：阳性参考液0.5ml + 2.5% 鼠疫FI抗体致敏血球0.05ml
（2）、微量法反向血凝试验的复判操作步骤
a、将初筛阳性的血清稀释两列，第一列为反向血凝抑制试验列，第二列为反向血凝试验列。标明被检血清编号及孔号。
b、第一列每孔内加抑制剂25μl，第二列每孔内加稀释剂25μl；
c、分别取被检血清25μl加入各列的第一孔内，吸排混匀4－6次，吸取25μl移入相应列的第二孔内，混匀。依此类推稀释至最后一孔，吸出25μl弃入消毒液中。置37℃温箱10－15分钟；
d、在第一、二列各孔中，用移液器加入1%的鼠疫FI抗体致敏血球液25μl。振荡混匀，置37℃2小时后观察结果。至此，每列第1孔的稀释度为1：40。
e、同时设下列对照各1孔
空白对照：稀释液25μl +1%鼠疫FI抗体致敏血球25μl。
    阴性对照：被检液25μl +1%单宁酸血球25μl。
    阳性对照：阳性参考血清25μl＋1%鼠疫FI抗体致敏血球25μl。
（3）、结果判定：方法同初筛试验结果判定
   被检材料中有相应的鼠疫抗原时，试验列呈现血球凝集，而抑制列中的抗原与加入的抗体中和，则再加入抗体致敏血球是不能和相应的抗原作用，红细胞不出现血球凝集。若出现血球凝集，则说明被检材料中有非特异性物质的存在。如果被检材料中所含抗原过多时，抑制列前几管可产生凝集现象（过剩的抗原与致敏血球产生凝集），当反向血凝抑制列呈“++”凝集的孔比反向血凝试验列少2孔以上，判定为反向血凝试验阳性。
（4）、最终结果：
空白对照、阴性对照孔不应呈现凝集，阳性对照成立。最终结果，当反向血凝抑制列呈“++”凝集的孔比反向血凝试验列少2孔以上，判定为特异性凝集。阳性血清最终效价为凝集排呈现“++”的最高稀释度。阳性标本应填写阳性报告单,并连同剩余标本严封,送上级业务主管单位进行再次复判。
八、影响因素
1、标本采集和处理
2、试剂的质量
3、器材的洁净度
4、人为因素
5、试验条件
九、注意事项
1、采集标本时严格遵守无菌操作。
2、实验后的剩余标本，应保存至获得最后结果时方可处理，标本阳性材料应妥善保存于冰箱中。
3、所用器材实验前要经过高温干烤灭菌使用。

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http://www.cdcman.com/bbs/viewth ... hlight=%CA%F3%D2%DF

鼠疫诊断标准已更新，且诊断分类变动较大，大家注意下