[传染病] 鼠疫相关资料 鼠疫, 资料

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列个开头，请大家将与鼠疫相关的资料规范分享在此。

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http://www.cdcman.com/bbs/viewth ... hlight=%CA%F3%D2%DF

鼠疫诊断标准已更新，且诊断分类变动较大，大家注意下

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乡约

八、复判方法：血凝抑制试验
1、原理：
是用一定量的鼠特异性F1抗原中和被检血清中鼠疫特异性F1抗体。若被检血清中含有鼠疫特异性F1抗体时，则可被F1抗原中和，呈肉眼不可见的中和反应。这种被中和的血清大部分或全部丧失了与鼠疫特异性F1抗原致敏血球发生凝集的能力，起凝集现象大部分或全部被抑制。这种现象称为血凝抑制阳性，证明被检血清中真正含有鼠疫特异性F1抗体；反之为阴性，说明是非特异性凝集。
2、复判的方法：
    两排复试：将被检血清平行倍比稀释两列，进行血凝抑制(第一排)、血凝(第二排) 两列试验 。
    复判前须将被检血清进行吸收：用正常醛化血球吸收非特异性凝集素。其方法是：1份被检血清加4份2.5%正常醛化血球（微量法：1%正常醛化血球），混匀后室温作用15~30分，1500转5分钟离心后取上清供试验用（此时被检血清为5倍稀释）。
⑴、试管法血凝试验的复判
1、操作步骤： 取小试管两列。
  A、第一列第一管加1％健康兔血清盐水0.9ml，其余各管加0.5ml ，为血凝抑制列。第二列各管内均加1％健康兔血清盐水0.25ml，为血凝列；
  B、于第一管内加入0.1ml被检血清，混匀后，吸取0.75ml至第一列第二管0.5ml、第二列第一管0.25ml。如此稀释至第最后1管，弃去0.5ml；
  C、于第1排各管内加入0.25ml鼠疫FI抗原抑制液（1％兔水稀释50～100μg/ml作为抑制液)，均匀后37 ℃作用10～15分钟；
  D、再向第1、第2列各管内加入2.5％鼠疫F1抗原致敏血球1滴，(此时两排稀释度均自1:20开始、如果被检血清吸收处理后则为5倍稀释，稀释度均自1：100开始),置37℃2h或室温2～3h观察结果。
2、同时设下列对照
空白对照：稀释液0.5ml +2.5%鼠疫FI抗原致敏血球0.05ml 。
阴性对照：1：20被检血清0.5ml + 2.5% 单宁酸血球0.05ml 。
阳性对照：阳性参考血清0.5ml + 2.5% 鼠疫FI抗原致敏血球0.05ml 。
⑵、 微量法血凝试验：
1、复判操作步骤：
   ①、将初筛阳性的血清稀释两列，第一列为血凝抑制试验列，第二列为血凝试验列。标明被检血清编号及孔号。
   ②、第一列每孔内加抑制剂25μl，第二列每孔内加稀释剂25μl。
   ③、分别取被检血清25μl加入各列的第一孔内，吸排混匀4－6次，吸取25μl移入相应列的第二孔内，混匀。依此类推稀释至最后一孔，吸出25μl弃入消毒液中。置37℃温箱10－15分钟。
   ④、在第一、二列各孔中，用移液器加入1%的鼠疫FI抗原致敏血球液25μl。振荡混匀，置37℃2小时后观察结果。至此，每列第1孔的稀释度为1：20。
2、同时设下列对照各1孔。
空白对照：稀释液25μl +1%鼠疫FI抗原致敏血球25μl。
阴性对照：1：20被检血清25μl +1%单宁酸血球25μl。
阳性对照：阳性参考血清25μl＋1%鼠疫FI抗原致敏血球25μl。
（3）、结果判定：方法同初筛试验结果判定
（4）、最终结果：
空白对照、阴性对照孔不应呈现凝集，阳性对照成立。当血凝抑制列呈“++”凝集的孔比血凝试验列少2孔以上，判定为特异性凝集。阳性血清最终效价为凝集排呈现“++”的最高稀释度。
后经两排复判，试管法血凝滴度在1：20，微量法血凝滴度在1：16以上时，即判为血凝阳性。填写“鼠疫血凝阳性”表逐级上报，并将被检材料立即送上级业务单位复查
九、影响因素
1、试剂的质量：致敏血球及稀释液等。
2、器材的洁净度：要洗净。
3、人为因素:不认真。
4、试验条件: 37℃2小时。
5、标本采集和血清分离:灭活及吸附
十、注意事项
1、试验用器材、器具要清洗要干净；使用过的，要洗净后再用蒸馏水冲洗1—2次，（防止残留的消毒液、洗液及阳性材料造成假阳性）干烤或高压处理。
2、微量血凝试验要使用一次性的“V”型微量血凝板。使用移液器加试剂。吸头也要使用一次性的，应与移液器配套。滴加各种试剂要准确，防止交叉污染。
3、试剂要注意保存条件和有效期，使用前应进行一次效价测定。血凝用各种试剂最好现用现配，4℃保存不易超过1周，室温不应超过2天。试剂污染是非特异性凝集的重要因素之一。
4、操作人员应熟练掌握技术，专心操作，操作过程中不得闲谈，动作要轻柔、准确。
5、被检血清、样品试验前应做灭活处理。灭活可消除大约80%的非特异反应。
6、每份标本要记录清楚，不能混淆。
7、注意血凝试验出现假阳性或非特异性凝集。多数情况下是由于所用器械不洁净、试剂污染造成的，如器械残留消毒剂或洗涤液中其他杂质成份，都会直接影响血凝结果。为避免发生非特异性凝集，首先要保证血凝试验所用器械清洁、干燥、无菌，尽量使用一次性用品。
•1∶1000肥皂水溶液可使血清产生非特异性凝集，来苏儿浓度为1∶5000时可使正常血清产生假阳性反应。
•用水质PH 8.0以上或含杂质较多的水洗涤血凝用品，可产生非特异性凝集。
•被检血清被杂菌污染和兔血清盐水对血凝试验的影响：据报导，每毫升兔血清盐水内含5000万以上杂菌，每毫升被检血清含5亿以上杂菌，血凝试验均可能产生非特异性凝集。（因此被检血清一定要灭活或吸收处理）。
试管法与微量法的不同？
1、在实际应用中两者所限阳性率无明显差异，但试管法的血凝滴度比微量法高5-10倍。
2、微量法结果清晰，对照稳定，器材节约，结果出现快，便于野外应用。
3、微量法要求器材的洁净度与试剂的纯度高，操作要精确和规范，在野外尤为注意。
反向间接血球凝集试验
一、概论
1、反向血球凝集试验：是相对于间接血球凝集试验而言。将已知鼠疫FI抗体致敏到经单宁酸处理的绵羊血球上，以检测样品中的鼠疫FI抗原是否存在，此方法称为反向血球凝集试验。
2、反向血凝试验多用于：分离鼠疫菌困难的情况下；对疑似鼠疫病人的诊断、动物鼠疫的判定。
3、特点 ：快速、敏感，有较高特异性,可检查活菌,死菌和可溶性抗原,可在污染材料中发现鼠疫菌抗原物质。
二、原理
是将鼠疫特异性抗体致敏到绵羊红血球上,以检查鼠疫菌特异性抗原的血清学方法.当这种抗体在适宜的介质中与相应的抗原相遇时,就会发生免疫化学反应,然后通过血球凝集现象表现出来.
三、材料收集与处理
1、动物材料：以无菌条件取动物肝脾3-5克，置于3-5毫升的1%升汞盐水， 制成1：10的材料；绞碎，3000转离心10分钟，取上清液备用。
2、腐败材料：取骨髓，黄鼠一般用0.5毫升 1%健康兔血清盐水冲洗，制成1：10的材料。
3、动物巢穴、排泄物、猛禽吐物、昆虫等材料。
四、试剂与器材
1、试剂
（1）稀释液：含1%正常兔血清的生理盐水。
（2）鼠疫FI抗体致敏血球。
（3）单宁酸血球：与鼠疫FI抗体致敏血球同一批次。
（4）抑制剂为1：100稀释的鼠疫免疫血清，含鼠疫FI抗体。
（5）阳性对照血清：
2、器材同上
五、具体步骤
（1）、试管法：
1、具体操作方法是：
a、将洁净的小试管10支排列在试管架上，第1管加0.9ml，其余各管加0.5ml1%健康兔血清盐水；
b、再将被检材料0.1ml加入第1管内，依次作倍比稀释，最后1管弃去0.5ml。
c、每管加入1滴2.5%鼠疫抗体致敏血球，振荡混匀，置37℃或室温2—3小时观察结果。
2、同时作如下对照:
空白对照：稀释液0.5ml +2.5%鼠疫FI抗体致敏血球1滴。
    阴性对照：被检液0.5ml +2.5%单宁酸血球1滴。
（2）、微量法：
1、初筛试验操作步骤：
a、每份被检液在V型孔微量血凝板稀释5孔。标明被检标本编号及孔号。
b、用移液器向每孔分别加入25μl 稀释液。
c、在第1孔中加入被检液25μl，吸排4－6次，充分混匀后，取25μl移至第2孔，充分混匀，依次稀释至最后一孔，弃掉25μl。
d、分别在各孔内加入1%鼠疫FI抗体致敏血球25μl，振荡混匀。置37℃温箱2h后观察结果。
2、 每批试验应设对照：
    空白对照：稀释液25μl +1%鼠疫FI抗体致敏血球25μl。
    阴性对照：被检液25μl +1%单宁酸血球25μl。
六、结果判定
1、红血球不凝集在管底或孔底呈致密的纽扣状，边缘光滑整齐，或呈现1个狭小的圆圈，为阴性结果。
2、红血球在管底或孔底呈不均匀分布，边缘呈翻伞状或不整齐的粗糙型，为阳性结果。  阳性结果又按红血球在管底或孔底部分凝集及边缘粗糙程度划为：
＃：凝集紧密，凝集物布满管底，有明显折边，抗体过量时， 凝集呈疏松花圈状。
＋＋＋：凝集血球铺满孔底，无折边。
＋＋：血球不完全凝集，在孔底呈整齐的圆圈或点，但圈内外或点外有非常明显的血球凝集。
＋：在孔底形成较小的圆圈或点，在圈外或点外只有很少的血球凝集。
  –：血球全部沉积在V型孔的底部，呈整齐的小珠状。
结果判定：以“++”凝集为阳性界限；该试管稀释倍数为反向血凝滴度。被检液出现阳性结果时要进行复判，以证明是否是特异性凝集
七、复判方法：反向血凝抑制试验
1、原理：
     利用特异性抗体中和血清中特异性抗原,则再次加入抗体致敏血球时不能再和相应抗原作用,红血球不呈现凝集现象,反之,若产生红血球凝集则说明血清中有非特异性物质存在。
2、复判的方法：
（1）、试管法复判：将被检液倍比平行稀释两排。第一排为反向血凝抑制试验，第二排为反向血凝试验
a、第一排第一管加0.8ml，其余各管加0.5ml 1％健康兔血清盐水；第二排各管内均加0.25ml1％健康兔血清盐水；
b、于第一排第一管内加入0.2ml被检抗原（稀释度为1:50），混匀后，吸取0.75ml至第一排第二管0.5ml、第二排第一管0.25ml。如此稀释至第10管；
c、于第1排各管内加入1:100稀释的抗鼠疫血清0.25ml，室温作用10～15分钟；
d、再向第1、第2排各管内加入2.5％鼠疫抗体致敏血球1滴，(此时两排稀释度均自1:100开始),置37℃2h或室温2～3h观察结果。血清稀释度为：1：100 200  400  800  1600  3600 …
e 、同时设下列对照：
空白对照：稀释液0.5ml +2.5%鼠疫FI抗体致敏血球0.05ml 。
阴性对照：被检液0.5ml + 2.5% 单宁酸血球0.05ml 。
阳性对照：阳性参考液0.5ml + 2.5% 鼠疫FI抗体致敏血球0.05ml
（2）、微量法反向血凝试验的复判操作步骤
a、将初筛阳性的血清稀释两列，第一列为反向血凝抑制试验列，第二列为反向血凝试验列。标明被检血清编号及孔号。
b、第一列每孔内加抑制剂25μl，第二列每孔内加稀释剂25μl；
c、分别取被检血清25μl加入各列的第一孔内，吸排混匀4－6次，吸取25μl移入相应列的第二孔内，混匀。依此类推稀释至最后一孔，吸出25μl弃入消毒液中。置37℃温箱10－15分钟；
d、在第一、二列各孔中，用移液器加入1%的鼠疫FI抗体致敏血球液25μl。振荡混匀，置37℃2小时后观察结果。至此，每列第1孔的稀释度为1：40。
e、同时设下列对照各1孔
空白对照：稀释液25μl +1%鼠疫FI抗体致敏血球25μl。
    阴性对照：被检液25μl +1%单宁酸血球25μl。
    阳性对照：阳性参考血清25μl＋1%鼠疫FI抗体致敏血球25μl。
（3）、结果判定：方法同初筛试验结果判定
   被检材料中有相应的鼠疫抗原时，试验列呈现血球凝集，而抑制列中的抗原与加入的抗体中和，则再加入抗体致敏血球是不能和相应的抗原作用，红细胞不出现血球凝集。若出现血球凝集，则说明被检材料中有非特异性物质的存在。如果被检材料中所含抗原过多时，抑制列前几管可产生凝集现象（过剩的抗原与致敏血球产生凝集），当反向血凝抑制列呈“++”凝集的孔比反向血凝试验列少2孔以上，判定为反向血凝试验阳性。
（4）、最终结果：
空白对照、阴性对照孔不应呈现凝集，阳性对照成立。最终结果，当反向血凝抑制列呈“++”凝集的孔比反向血凝试验列少2孔以上，判定为特异性凝集。阳性血清最终效价为凝集排呈现“++”的最高稀释度。阳性标本应填写阳性报告单,并连同剩余标本严封,送上级业务主管单位进行再次复判。
八、影响因素
1、标本采集和处理
2、试剂的质量
3、器材的洁净度
4、人为因素
5、试验条件
九、注意事项
1、采集标本时严格遵守无菌操作。
2、实验后的剩余标本，应保存至获得最后结果时方可处理，标本阳性材料应妥善保存于冰箱中。
3、所用器材实验前要经过高温干烤灭菌使用。

乡约

鼠疫血清学检验
一、发展史及重要性       
鼠疫是严重的烈性传染病。50年代以前，鼠疫的诊断主要靠分离病原菌的方法作为依据。但由于鼠疫菌只能在动物鼠疫流行猛烈或动物倒毙时才能分离到。从活动物体内分离的鼠疫菌仅为死动物的5‰。某些因素如被检材料的腐败程度、鼠疫病人取材前是否服用过抗生素、病原菌的毒力等均可不同程度地影响到鼠疫菌的分离。因此，仅靠细菌学的诊断已不能满足鼠疫疫源检索、动物鼠疫调查、鼠疫病人诊断等的需要。
从上世纪20年代，国内外学者就不断地寻找理想的鼠疫血清学诊断方法，以求解决细菌学所不能解决的问题。经过几十年的努力，鼠疫血清学诊断的研究有了迅速的发展，取得了可喜的成果。许多实用有效的血清学检测技术，在鼠疫防治领域内已得到广泛应用。
二、相关的基本知识
1、血清学检验的机理实质就是抗原抗体免疫化学反应。抗原（Antigen Ag）或抗体（Antibody Ab）与其相对应的特异抗体或抗原在一定条件下（适宜的反应介质和温度），可发生免疫化学反应生成特异的抗原—抗体复合物。
2、抗原（Antigen Ag）：能刺激机体免疫系统诱导免疫应答并能与应答产物抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应得物质，分为可溶性抗原和颗粒性抗原。
3、抗体（Antibody Ab）机体的免疫系统受A刺激后，由浆细胞合成分泌的一类能与抗原发生特异性结合的一类球蛋白。是B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质。主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。
4、补体(Complement  C)新鲜血清中存在一种不耐热的成分（56°C 30／灭活），可辅助特异性抗体介导的溶菌或溶细胞作用。
5、F1抗原 ：是鼠疫菌在37度培养下，在菌体周围生长的一层封套物质中的一部分。系多糖蛋白质复合物，是鼠疫菌的特异性性抗原之一。常用于F1抗体的检测。为可溶性抗原。
6、可溶性抗原：指蛋白质、糖蛋白、细菌毒素等.可溶性抗原与抗体反应不能通过肉眼直接观察,所以需要借助载体发生肉眼可见的凝集现象。常用载体有红细胞、胶乳颗粒和炭颗粒。
三、分类
目前,用于鼠疫血清学诊断的检测技术大体上分为二类,一类是检查鼠疫菌抗体的血清学检验，另一类是检查鼠疫菌抗原的血清学检验。
（一）、鼠疫抗体的血清学检验：
1、检查的对象：
⑴、人：细菌分离阴性的疑似鼠疫病人；抗生素特异治疗的恢复期病人或患过鼠疫的康复者；疫区内受过鼠疫菌感染，但未出现临床症状或症状不显者。以上三种情况均取血检查有无鼠疫菌抗体以进行诊断或追溯诊断。
⑵、:动物：疫源地内主要宿主动物；疫源地内其他种类动物（如食肉类、捕食鼠类的动物。特别是狗感染鼠疫后能产生高滴度的鼠疫抗体，利用犬可作为检查鼠疫疫源的指示动物。）
2、主要方法：
间接血球凝集试验
酶联免疫吸附试验
胶体金免疫层析滤纸条
放射免疫沉淀试验
（二）、鼠疫抗原的血清学检查
1.检查对象:
⑴人或动物脏器:对于疑似鼠疫的人和啮齿动物尸体,特别是在脏器腐败无法查到鼠疫菌的情况下,检查有无鼠疫菌抗原的存在,可以做出是否患过鼠疫的诊断,也是快速诊断鼠疫的重要方法之一,对早期判定人、鼠间疫情具有重要意义。
⑵其他疑似被检材料:宿主动物体上寄生的蚤类等传播媒介、洞穴的土壤、猛禽的唾液、被鼠疫菌污染的皮毛、衣服等均可检查有无鼠疫菌抗原，可为追溯传染源，判定疫情等提供依据。
2、主要方法：
反向间接血球凝集试验
酶联免疫吸附试验
胶体金免疫层析滤纸条
放射免疫分析
免疫荧光试验
鼠疫间接血球凝集试验
一、概述
间接红血球凝集试验(IHA)，它是一种敏感性高、特异性强的血清学诊断方法。由于红细胞被动地凝集在一起，故又称为被动血凝试验（PHA)。
1、特点：
a. 敏感性高：可检测出微量抗体；
b. 时间短、快速：在2-3h内可出结果；
c. 特异性好：FI抗原抗体反应特异性高，与假结核血清出现交叉反应不超过
1：5；
d. 诊断制剂制作简单、稳定；抗原致敏血球可冷藏保存1-2年，敏感性和特异性不受影响；
f. 设备简单，不需要特殊设备
2、应用：
a. 疑似鼠疫患者的诊断和追溯诊断；
b. 开展动物鼠疫流行调查和流行规律的调查；
c. 用于实验研究，观察抗体的产生；
d. 对鼠疫菌苗和菌苗免疫效果进行评价等方面。
二、原理
间接红血球凝集试验又称为被动血凝试验，简称间接血凝实验。为了大家理解这个实验，我先介绍几个概念：
凝集反应：在细菌或血球颗粒性抗原悬液中,加入含有特异性抗体的血清和适宜的介质的情况下,使细菌或血球凝集成结块的现象叫凝集反应.存在于血清中的抗体叫凝集素，与凝集素相结合的抗原叫凝集原.凝集反应又分为直接凝集反应和间接凝集反应。
直接凝集：抗原抗体反应过程中，抗原如果是颗粒性的，当与相应的抗体在生理盐水中反应时，颗粒性抗原表面的抗原决定簇与相应的抗体结合并逐步形成肉眼可见的大凝集块，此种反应为直接凝集。
间接凝集：若抗原是水溶性的则只是抗原抗体发生免疫反应，形成抗原-抗体复合物，但此复合物是肉眼不可见的，需加入相应的载体，借助载体的凝集出现可见反应，此种反应称为间接凝集。
间接红血球凝集试验(IHA)原理：将鼠疫菌特异性F1抗原致敏于经单宁酸处理醛化的绵羊红血球上，以检查鼠疫特异性F1抗体的血清学方法。这种反映结果可通过血球凝集表现出来，是一种半定量试验。
三、检查对象
1、人：
a.细菌分离阴性的疑似鼠疫病人；
b.抗生素特异治疗的恢复期病人或患过鼠疫的康复者；
c.疫区内受过鼠疫菌感染，但未出现临床症状或症状不显者。
2、动物：
a.疫源地内主要宿主动物；
b.疫源地内其他种类动物（如食肉类、捕食鼠类的动物）。特别是狗感染鼠疫后能产生高滴度的鼠疫抗体，利用犬可作为检查鼠疫疫源的指示动物。
四、材料采集及处理
1、材料采集：
  ⑴鼠疫患者及疑似鼠疫病人血清的采集：常规无菌操作取静血3-5ml，注入灭菌试管分离血清。
  ⑵动物血清的采集：
①心脏采血：较大的被检动物用此法。将动物固定，在心脏搏动明显处用碘酒和酒精消毒，用灭菌注射器刺入抽取血液3－5ml，注入灭菌中试管，摆成斜面，凝固后直立分离血清。
②股动脉放血：一般啮齿动物用此法。固定动物，消毒腹股沟处皮肤，用灭菌剪刀剪一小口，暴露股动脉，剪断血管，使血液直接流入灭菌中试管，摆成斜面，凝固后直立分离血清。
③滤纸片法：常用于不能采足量血的小型啮齿动物和死亡动物。选用1×7cm的滤纸条，用镊子夹住滤纸条一端，沾取心腔或其他脏器内的全血及渗出液，击伤动物可于伤口采血。标号干燥后保存。用时剪取3.5cm滤纸条（含血清量约0.1ml），加入0.9ml生理盐水，浸泡1h，取上清（相当于血清1：10稀释）备用。
④毛细管采血：适用于小型啮齿动物调查。固定动物，消毒被检动物尾部或足趾，用剪刀剪一切面，挤出血液，选择直径1mm,长6～7cm的灭菌毛细管吸取，一端用火焰或蜡封闭后离心，灭活后，锯取0.65cm长有血清的毛细管（含血清0.005ml），用于微量法血凝试验。
2、.材料处理：
   血清标本应经56℃30分钟灭活，保存在4℃待检。如需长期保存则加入叠氮钠 或1%硫柳汞 。
五、实验用品
1、试剂：
①2.5%F1抗原致敏血球：（有10％冻干血球和10％混悬液血球两种制品。贮存于4℃～8℃内2年内不失效，室温保存至少半年以上。用前以1％健康兔血清盐水稀释成2.5％血球悬液供试管法用。最好当天使用，若延期使用应置冰箱，不宜超过1周。）(a.用细菌凝集效价为1：320的鼠疫全菌免疫血清，血凝滴度应不低于1：40000 。b.与假结核血清交叉滴度应不高于1：5。符合a)、b.）的致敏血球为合格的诊断血球。
②1%正常兔血清盐水：供稀释液用。
③2.5%单宁酸血球：供复查阳性血清使用，与鼠疫FI抗原致敏血球同一批次。
④醛化正常血球:供被检血清非特异性凝集素的吸收处理。
⑤鼠疫F1抗原：供血凝3排复判时抑制试验用(用时以1％兔水稀释成50～100μg/ml作为抑制液)。
○6阳性参考血清。
2、器材：
○1、仪器：冰箱、温箱、离心机等；
○2、玻璃器皿：吸管、试管、烧瓶等；
○3、其他：试管架、吸耳球、加样器、微量血凝板等。
（一次性用品一次性微量血凝板，吸头等要一次性使用，不要重复用。高值用品加样器、离心机等仪器、设备，要爱护，定期对准确性进行检测。）

六、具体操作
（一）、试管法：
1.、将小试管排列在试管架上，标明管号：
a、向第1管内加入0.9ml1%健康兔血清盐水，以后每管各0.5ml；
b、取被检血清0.1ml，加入第1管中，混匀后行倍比稀释，最后1管取0.5ml弃去；
c、再用1ml刻度吸管，向各管滴加2.5%F1抗原致敏血球1滴（0.05ml），振荡混匀血球，置37℃温箱或室温2-3小时观察果；
2、致敏血球敏感性测定一般做15管，疑似材料做6管，如系调查时初筛试验可做2管，即1：10和1：100。
3、试验应设对照：
    空白对照：稀释液0.5ml +2.5%鼠疫FI抗原致敏血球1滴。
    阴性对照：1：20被检血清 0.5ml +2.5%单宁酸血球1滴。
一般现场材料不使用阳性对照，以免混淆结果。
（二）、微量法:
1、具体操作方法是：
   ①每份被检血清在V型孔微量血凝板稀释5孔。标明被检血清编号及孔号。
   ②用移液器向每孔分别加入25μl 稀释液；
   ③在第1孔中加入被检血清25μl，吸排4－6次，充分混匀后，取25μl移至第2孔，充分混匀，依次稀释至最后一孔，弃掉25μl；
   ④分别向各孔内加入1%鼠疫FI抗原致敏血球25μl，振荡混匀。此时从第1孔开始，被检血清的最终稀释度为1：4、1：8、1：16……，以此类推。置37℃温箱2h后观察结果。
2、 每批试验应设对照：
    空白对照：稀释液25μl +1%鼠疫FI抗原致敏血球25μl。
    阴性对照：1：20被检血清25μl +1%单宁酸血球25μl。
七、结果判定
1、红血球不凝集在管底或孔底呈致密的纽扣状，边缘光滑整齐，或呈现1个狭小的圆圈，为阴性结果。
2、红血球在管底或孔底呈不均匀分布，边缘呈翻伞状或不整齐的粗糙型，为阳性结果。  阳性结果又按红血球在管底或孔底部分凝集及边缘粗糙程度划为：
#：呈疏松花团状或凝集物紧密，凝集物布满管底，有明显的折边。
＋＋＋：凝集血球铺满孔底，无折边。
＋＋：血球不完全凝集，在孔底呈整齐的圆圈或点，但圈内外有非常明显的血球凝集。
＋：在孔底形成较小的圆圈或点，在圈外或点外只有很少的血球凝集。
–：血球全部沉积在孔的底部，呈整齐的小珠状或圆圈。
3、结果判定：
     国内以‘++’为血凝试验阳性。被检血清出现阳性结果时要进行复判，以证明是否是特异性凝集。
4、被检血清出现阳性结果时为什么要复判？
    在间接血凝试验中，因为有的被检材料含有非特异性物质、受污染或试验时所用器材不洁及试剂不纯等因素的影响，可使F1抗原致敏血球出现非特异性凝集，出现假阳性结果。因此，血凝试验出现阳性时必须进行复判。