结核与免疫 结核, 免疫

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结核与免疫
随着细胞和分子免疫学研究的进展，有关细胞因子（cytokine，CK）网络在结核病免疫发病中的作用有了广泛而深入的研究，并为中医药治疗结核病研究指明了路径。什么是细胞因子网络呢？原来我们的身体内有一套非常精密的免疫系统，正常情况下可抵御入侵的病原微生物，中医喻为"正气存内，邪不可干"。介导结核病免疫的T淋巴细胞依其分泌细胞因子的不同而分为Th1/Th2细胞。Th1型CK如白细胞介素2（IL-2）、IL-12、干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子β（TNF-β）等，促进细胞免疫；Th2型CK如IL-4、IL-5、IL-9、IL-10等，它们大多抑制细胞免疫。二者在体内的动态平衡，构成了调节人体免疫系统平衡的网络-----细胞因子网络。
正常情况下，当人体感染结核杆菌时，多种细胞可分泌Th1型细胞因子如IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-18等。IFN-γ为单核巨噬细胞的激活剂，并可促使细胞毒T细胞（CTL）和其它效应细胞聚集于病变部位，来消灭结核杆菌，在控制结核分支杆菌感染中起着重要作用。在感染早期，IFN-γ主要由CD+4T细胞分泌，后期由于人体在结核杆菌的复杂的免疫抑制因子作用下，继发细胞免疫缺陷，CD+4T淋巴细胞数量减少，功能低下，这时候IFN-γ主要由CD+8T淋巴细胞来分泌，但产生IFN-γ的量大为减少，结核病就可能得到发展。此外，巨噬细胞不仅具有吞噬杀灭结核杆菌的作用，也可产生IFN-γ等细胞因子，从而上调机体细胞免疫应答。临床观察发现，结核病人低下的免疫状况随着治疗中体内结核杆菌量的减少而得到改善，进一步说明结核杆菌具有抑制人体细胞免疫的功能[3]。
Th2型细胞因子如IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等，主要功能为下调细胞免疫反应，即抑制IFN-γ的产生，正常情况下有双向调节免疫功能的作用，在防止自身免疫性疾病中有着至关重要的作用。但在结核病免疫中却有抑制巨噬细胞产生一氧化氮（NO，化学杀菌物质），对单核巨噬细胞、T细胞、NK细胞产生免疫抑制作用，并刺激B淋巴细胞和肥大细胞，使机体产生超敏体液反应，除可加重结核病变外，还可使机体出现循环免疫复合物（CIC）增多[2]，进一步损伤人体组织器官。
当我们知道了这些细胞因子的作用后，就为我们治疗结核病打开了一扇智慧的大门，我们会发现，当一味注重杀菌的化学疗法在面临诸如结核分支杆菌的耐药性、毒副作用、机体的免疫缺陷等等难题时，我们还有更多的选择。在这方面，国外学者起步较早，主要在以下两个方面取得了进展：一是试制开发具有增强Th1型T淋巴细胞因子反应而抑制Th2型细胞因子反应的抗结核DNA疫苗，取得了可喜成果，有望成为预防结核病的有效疫苗。二是借助外源性药物对细胞因子网络的干预来防治结核病。主要使用干扰素γ（IFN-γ）和干扰素α（IFN-α），对耐多药结核病患者进行治疗，结果令人满意；另有学者使用白细胞介素来治疗结核病，同样取得满意效果。但是这些外源性药物价格昂贵，体内作用时间短，并有发热等副作用而限制了其在临床上的使用。
    有没有更好的方法既能调节人的免疫功能，又没有毒副作用呢？其实我们的中华医学宝库正需要我们去开发，大量的现代基础研究证明，多种补肾中药具有整体调节人体"神经内分泌免疫网络"的作用[4]，它可比作人体内的"因特网"，而细胞因子网络只能算"局域网"。经过合理组方的抗结核中药，可促进内源性细胞因子（CK）的分泌，并用反馈机制来精密地双向调节人体免疫功能这把"双刃剑"，达到治愈结核病和免疫重建。
目的　观察肺结核患者CD4、CD8淋巴细胞变化 ,探讨其免疫状态的改变及其意义。方法　用流式细胞仪测定 31例成人肺结核及 12例对照组的CD4、CD8计数值 ,对测定结果进行统计学分析。结果　病人组CD4值明显下降 ,CD8值无明显变化 ,CD4下降幅度与病情严重程度、排菌状态无明显关联。结论　成人肺结核患者存在以CD4T淋巴细胞下降为突出表现的细胞免疫受损 ,但其对病情发生、发展无独立的影响作用。

机体免疫防御机制
人体的免疫系统通过免疫细胞和免疫分子保护机体不受外界微生物和病原体的侵害，生理情况下，促炎反应与抗炎反应处于动态平衡状态。当机体受到严重感染时，可发生剧烈的防御反应，一方面通过增强促炎反应达到免疫防御和免疫自稳的作用，另一方面激活各种免疫调节细胞，释放大量细胞因子，发挥抗炎作用。外界抗原透过人体的免疫屏障可激活人体固有免疫及适应性免疫系统。固有免疫主要通过抗原非特异免疫机制招募免疫细胞到感染部位引发炎症反应，激活补体级联反应并清除侵入机体的外源性物质。固有免疫细胞主要包括单核巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞等。固有免疫应答中的细胞、细胞因子及趋化因子是启动适应性免疫并且决定适应性免疫类型的基本要素。适应性免疫应答通过固有免疫细胞的特异性抗原提呈作用被激活，T淋巴细胞经抗原提呈分子激活后分泌细胞因子，B淋巴细胞被激活为浆细胞，分泌特异性抗体参与体液免疫，同时一部分B细胞在该过程中以记忆细胞的形式保存下来，二次感染时，记忆性B淋巴细胞可以直接产生特异性抗体抵御相同病源的再次感染。活化的效应T细胞包括辅助性T细胞和细胞毒性T细胞，参与细胞免疫过程。为防止炎症反应过度活化对机体造成损伤，机体促炎反应激活的同时往往伴随诱导抗炎反应，促炎反应与抗炎反应相互制约，共同决定免疫应答走向。

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结核免疫学检测
1. 抗结核抗体检查：通过特异性较强的结核菌体成分作为检测抗原检测血清中的抗结核抗体对结核菌病进行辅助诊断，是一种快速、简单、有较好特异性和敏感性，对抗酸染色阴性及不容易取得细菌学检查标本的肺外结核病、儿童结核病有较高的诊断价值。根据检测方法的不同有：凝集试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫斑点法、免疫胶体金法等。
2. 结核菌素试验：凡感染过结核菌的机体会产生相应的致敏淋巴细胞，具有对结核杆菌的识别能力，当再次遇到通过皮肤注射的结核菌纯蛋白衍生物（PPD）
时，产生局部的炎症反应，出现红肿硬结。结核菌素试验 72 h（48 h～96 h）检查反应，以局部皮下硬结为准：
阴性：硬结平均直径＜5 mm 或无反应者为阴性。
硬结平均直径 5 mm～9 mm 为一般阳性。
硬结平均直径 10 mm～19 mm 为中度阳性。
硬结平均直径 ≥ 20 mm（儿童 ≥ 15 mm）或局部出现水泡、坏死及淋巴管炎者为强阳性。
结核菌素试验对活动性结核的诊断灵敏度可达将近 80%，但免疫力低下患者会出现假阴性，而且不能区分结核菌感染还是卡介苗接种。
3. γ干扰素释放试验：结核杆菌感染后体内长期存在致敏的 T 淋巴细胞（包括 CD4+ 和 CD8+T 淋巴细胞），当再次遇到抗原刺激时可用迅速活化释放γ干扰素，通过检测释放的γ干扰素可以确定患者体内是否存在被结核杆菌致敏的 T 淋巴细胞。阳性患者可能是活动性结核病患者、既往感染者或潜伏感染者。最常用的检测方法是酶联免疫斑点试验，即 T-SPOT.TB。

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结核免疫学研究

肺结核（tuberculosis，TB）是结核分枝杆菌造成的常见传染病，涉及一系列巨噬细胞与分支杆菌间的相互作用。人体抵御TB的第一道防线是免疫细胞巨噬细胞，它能够吞噬细菌，且试图将其分解。在很多情况下，巨噬细胞能够成功的杀死细菌，预防TB感染，但在有些时候引发TB的细菌不仅能够逃脱被杀的命运，还能借助巨噬细胞到达宿主的深处。接下来，细菌会引发感染的巨噬细胞形成结节或肉芽肿。此时，巨噬细胞和细菌会再次开战，如果前者输了，细菌就会开始在细胞间传播。溶酶体是巨噬细胞中负责破坏细菌的关键组成部分，在溶酶体中它的功能就像“切碎”细菌的剪刀。除了破坏细菌，巨噬细胞还会从体内回收不需要的材料进行再利用，而溶酶体贮积症恰恰影响了这一关键的操作。研究人员解释道：“巨噬细胞的作用很像真空吸尘器，吸收体内的碎片和多余材料，包括每天死去的数十亿细胞。有缺陷的巨噬细胞不能再利用这些碎片，慢慢开始堵塞，越来越大，变胖，失去移动和清除其它材料的能力。”
事实上，在TB肉芽肿形成时，宿主最好的对策是以缓慢平稳的速度派去更多的巨噬细胞帮助已感染的巨噬细胞，但是如果这些因堵塞而不能移动的巨噬细胞无法进入TB肉芽肿，被感染的巨噬细胞破裂后会成为细菌的“营养汤”，帮助其快速生长和扩散，使感染更糟。
来源Cell：吸烟引发“巨噬细胞”堵塞http://mp.weixin.qq.com/s?__biz= ... aUR1zz6rmDgKbJrm#rd

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T细胞是“哨兵”细胞，发现外来细胞便发出警报，动员体内的排斥系统对外来细胞进行攻击。

T淋巴细胞是机体细胞免疫功能的主要效应细胞，其中包含CD4、＋CD8＋等T淋巴细胞亚群，并在机体中保持稳态。但其平衡一旦被打破，机体免疫功能降低，易受病菌侵害。研究发现，白细胞介素2可通过调节结核性胸膜炎患者CD4、＋CD8＋等T淋巴细胞亚群的表达水平进而纠正患者免疫功能失调。

MTB为兼性胞内寄生菌，因而机体抗结核特异性免疫主要以细胞免疫为主。其中CD4T淋巴细胞是结核病患者产生免疫反应的主要效应细胞。机体抗结核免疫中CD4T淋巴细胞作为辅助性T淋巴细胞亚群可促进免疫细胞增殖分化并在机体中放大免疫效应，进而增强免疫功能，对抗消灭MTB。

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一、抗原受体
TCR[抗原受体]
T细胞(抗原)受体(TCR)为所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR的作用是识别抗原。TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体，由α、β两条肽链组成，每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区等几部分;其特点是胞质区很短。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区;V区(Vα、Vβ)又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，CDR1，CDR2识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁，而CDR3直接与抗原肽相结合。



二、抗结核免疫主要是细胞免疫，包括致敏的T淋巴细胞和被激活的巨噬细胞。
致敏的T淋巴细胞可直接杀死带有结核杆菌的靶细胞，同时对释放多种作用于世噬细胞的淋巴因子，使巨噬细胞聚集在病灶周围形成以单核细胞为主的增生性炎症。被激活的巨噬细胞极大地增强对结核杆菌的吞噬消化，抑制繁殖，阻止扩散，甚至将其销毁的能力，充分发挥细胞免疫的作用。

三、感染结核杆菌后，机体主要通过特异性细胞免疫的作用将其消灭 。
在这个过程中主要是通过巨噬细胞的吞噬作用先对侵入的结核杆菌进行包裹形成肉芽肿，然后通过诱导CD4+T细胞向Th1细胞分化。

四、为什么人体消灭结核杆菌的免疫方式是细胞免疫而没有体液免疫，难道发生细胞免疫后，抗原就被干掉了？如果没有体液免疫的抗体那是被怎么消灭的？----结核分支杆菌的免疫性 、免疫机制:

答：结核分枝杆菌是胞内感染菌，其免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫。T细胞不能直接和胞内菌（被巨噬细胞吞噬的结核分枝杆菌）作用，必须先与感染细胞（巨噬细胞吞噬的结核分枝杆菌）反应，导致细胞崩溃，释放出结核分枝杆菌。机体对结核分枝杆菌虽能产生抗体，但抗体只能与释出的细菌才能接触，所有只能起辅助作用。结核分枝杆菌侵入呼吸道后，由于肺泡中80%～90% 是巨噬细胞，10% 是淋巴细胞（T细胞占多数）；原肺泡中未活化的巨噬细胞抗菌活性弱，不能防止所吞噬的结核分枝杆菌生长，反可将结核分枝杆菌带到他处。但它可递呈抗原，使周围T淋巴细胞致敏。致敏淋巴细胞可产生多种淋巴因子，如IL-2、IL-6、INF- γ，他们与TNF-α的共同作用可杀死病灶中的结核分枝杆菌。淋巴因子中INF-γ是主要的。有多种细胞能产生INF- γ，病灶周围浸润的先后为NK、γ /δT和CD4+、CD8+α/βT细胞。上述细胞有的可直接杀伤靶细胞，有的产生淋巴因子激活巨噬细胞，使吞噬作用加强引起呼吸暴发，导致活性氧中介物和活性氮中介物的产生而将病菌杀死。

机体内的T细胞根据抗原受体（TCR）的不同可分2种：一种由α链与β链组成，称α/βT细胞（含CD4或CD8标志），另一种由? 链和δ链组成，称γ /δT细胞（大多无CD4或CD8标志）。人与小鼠外周血中前者大于90%，后者<10%。在抗分枝杆菌免疫中这2种T细胞均起到重要作用。在感染早期α/βT细胞尚未升至高峰时，结核分枝杆菌受γ/δT细胞控制。在与结核分枝杆菌接触后 γ /δT细胞即大量增殖。健康人经分枝杆菌提取物刺激7～10d后，外周淋巴细胞中γ /δT细胞可有所增加，其作用与α/βT细胞同样可杀伤结核分枝杆菌。近年来证明小鼠感染牛分枝杆菌后γ /δT细胞迅速汇集到炎症区，增殖的主要是V 9δ2T细胞亚群，但人发生活动性结核时此亚群有所下降。
近年来注意到γ /δT细胞攻击的主要是分枝杆菌中的一种热休克蛋白(heat shock protein,HSP）。HSP是一种具有高度保守性的蛋白质，从原核细胞到动植物中均有，其氨基酸顺序有50%同源。在正常生物中含量极少，但在感染、发热、细胞恶变等外界环境条件改变时即大量产生，故HSP又称应激蛋白（stress protein）。HSP在许多病原菌中均有，其氨基酸序列有共同成分，不同细菌引起的亚临床感染均可引起一定程度相同的免疫，被认为是非特异性免疫。
五、结核的免疫属于感染免疫（infection immunity），又称有菌免疫，即只有当结核分枝杆菌或其组分存在于体内时才有免疫力。一旦体内的结核分枝杆菌或其组分全部消失，免疫也随之不存在。


六、免疫与超敏反应:
随着机体对结核分枝杆菌产生保护作用的同时，也可以看到有迟发型超敏反应的产生，二者均为T细胞介导的结果。从郭霍现象(Koch phenomenon)可以看到，将结核分枝杆菌初次注入健康豚鼠皮下, 10~14d后局部溃烂不愈，附近淋巴结肿大，细菌扩散至全身，表现为原发感染的特点。若以结核分枝杆菌对以前曾感染过结核的豚鼠进行再感染 ，则于1~2d内局部迅速产生溃烂，易愈合。附近淋巴结不肿大，细菌亦很少扩散，表现为原发后感染的特点。可见再感染时溃疡浅、易愈合、不扩散，表明机体已有一定免疫力。但再感染时溃疡发生快，说明在产生免疫的同时有超敏反应的参与。近年来研究表明结核分枝杆菌诱导机体产生免疫和超敏反应的物质不同。超敏反应主要由结核菌素蛋白和蜡质D共同引起，而免疫则由结核分枝杆菌核糖体RNA(rRNA)引起。二种不同抗原成分激活不同的T细胞亚群释放出不同的淋巴因子所致。
七、 结核菌素试验:结核菌素试验是应用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆菌是否能引起超敏反应的一种试验。1.结核菌素试剂:以往用旧结核菌素(old tuberculin,OT)。系将结核分枝杆菌接种于甘油肉汤培养基，培养4~8周后加热浓缩过滤制成。稀释2 000倍，每0.1ml含5单位。目前都用纯蛋白衍化物(purified t i D protein derivative,PPD)。PPD有二种:人结核分枝杆菌制成的PPD‐C和卡介苗制成的BCG‐PPD。每0.1ml含5单位。2.试验方法与意义:常规试验分别取2种PPD 5个单位注射两前臂皮内，48~72h后红肿硬结超过5mm者为阳性，≥15mm为强阳性，对临床诊断有意义。若PPD‐C侧红肿大于BCG‐PPD侧为感染。反之，BCG‐PPD侧大于PPD‐C侧，可能系卡介苗接种所致。 阴性反应表明未感染过结核分枝杆菌，但应考虑以下情况:①感染初期，因结核分枝杆菌感染后需4周以上才能出现超敏反应;②老年人;③严重结核患者或正患有其他传染病，如麻疹导致的细胞免疫低下;④获得性细胞免疫低下，如艾滋病或肿瘤等用过免疫抑制剂者。为排除假阴性，国内有的单位加用无菌植物血凝素(PHA)针剂 ，0.1ml含10μg作皮试。若24h红肿大于PHA皮丘者为细胞免疫正常，若无反应或反应不超过PHA皮丘者为免疫低下。
八、 微生物学检查法结核病的症状和体征往往不典型，虽可借助X线摄片诊断，但确诊仍有赖于细菌学检查。标本 标本的选择根据感染部位。可取痰、支气管灌洗液、尿、粪、脑脊液或胸、腹水。其他肺外感染可取血或相应部位分泌液或组织细胞。直接涂片镜检 标本直接涂片或集菌后涂片，用抗酸染色。若找到抗酸阳性菌即可初步诊断。抗酸染色一般用Ziehl‐Neelsen法。为加强染色，可用IK(intensified Kinyoun)法染色。将石炭酸复红染色过夜，用0.5% 盐酸乙醇脱色30s，则包括大多结核分枝杆菌L型也可着色。为提高镜检敏感性，也可用金胺染色，在荧光显微镜下结核分枝杆菌呈显金黄色荧光。 浓缩集菌 先集菌后检查，可提高检出率。培养与动物试验也必须经集菌过程以除去杂菌。脑脊液和胸、腹水无杂菌，可直接离心沉淀集菌。痰、支气管灌洗液、尿、粪等污染标本需经4% NaOH(痰和碱的比例为1:4,尿、支气管灌洗液和碱的比例为1:1)处理15min，时间过长易使结核分枝杆菌L型与非结核分枝杆菌死亡。尿标本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于锥形量筒内静置，取沉淀物处理。处理后的材料再离心沉淀。取沉淀物作涂片染色镜检。若需进一步作培养或动物接种，应先用酸中和后再离心沉淀。 • 分离培养 将经中和集菌材料接种于固体培养基，器皿口加橡皮塞于37℃培养，每周观察1次。结核分枝杆菌生长缓慢，一般需2~4周长成肉眼可见的落菌。液体培养可将集菌材料滴加于含血清的培养液，则可于1~2周在管底见有颗粒生长。取沉淀物作涂片，能快速获得结果，并可进一步作生化、药敏等测定和区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。国内学者已证明结核分枝杆菌L型可存在于血细胞内或粘附于细胞表面。这种患者往往血沉加快，用低渗盐水溶血后立即接种高渗结核分枝杆菌L型培养基能提高培养阳性率。 动物试验 将集菌后的材料注射于豚鼠腹股沟皮下，3~4周后若局部淋巴结肿大，结核菌素试验阳转，即可进行解剖。观察肺、肝、淋巴结等器官有无结核病变，并作形态、培养等检查。若6~8周仍不见发病，也应进行解剖检查。 快速诊断 一般涂片检查菌数需5x103~4/ml,培养需1x102/ml,标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果，且培养需时较长。目前已将多聚酶链反应(PCR)扩增技术应用于结核分枝杆菌DNA鉴定，每ml中只需含几个细菌即可获得阳性，且1?2d得出结果。操作中需注意实验器材的污染问题，以免出现假阳性。又细菌L型由于缺壁并有代偿性一 细胞膜增厚，而 般常用的溶菌酶不能使细胞膜破裂释出DNA，以致造成PCR假阴性。用组织磨碎器充分研磨使细胞破裂后，则可出现阳性。目前有条件的单位使用BACTEC法，以含14C棕榈酸作碳源底物的7H12培养基，测量在细菌代谢过程中所产生的14C量推算出标本中是否有抗酸杆菌，5~7d就可出报告。 近年来国内外研究证明临床各种类型的肺结核患者中40% 左右分离出L型。经治疗的结核病人细菌型消失，L型常持续存在。有空洞患者痰中已不排细菌型者，8% 左右仍可检出L型。故有学者建议将多次检出L型亦作为结核病活动判断标准之一，细菌型与L型 均转阴才能作为痰阴性。