卡介苗的改造策略

　　【关键词】卡介苗：失效原因；改造策略

　　结核病（TB）仍然是威胁人类生命健康的重要疾病之一，全球每年近300万人死于该病。人类免疫缺陷病毒（HIV）感染、耐药菌株的增加使结核病的发病率和死亡率大幅上升。目前唯一获准用于预防结核病，普遍使用的设苗是卡介苗（BCG）。经多年的使用发现，儿童接种后可获得良好的保护效果，但对成人保护效果差异较大，不同的人群保护力从0%-80%不等。虽然有新型疫苗出现，但保护效果尚不能超越现有的BCG。如何发现BCG的不足，对现有BCG进行合理改造是结核病疫苗研究的方向之一。本文就BCG失效的原因及改造BCG的策略作一综述。

　　1 BCG的保护效果及失效原因

　　BCG自从1948年普遍使用以来，已有30多亿人接种用于预防结核病。不同年龄、不同地区的人群接种后，其保护效果有较大差异。儿童有较高的保护力，可防止结核性脑膜炎和粟粒性结核的发生，而成人保护效果差，在非洲和印度等环境中非结核分枝杆菌流行率高的地区保护效果更差，甚至根本无保护力（如在马拉韦的Karonga地区和印度的Chingleput地区）。BCG失效的原因一直是个争论的话题。由于免疫接种使用的BCG菌株差异，免疫接种年龄不同，接种人群遗传背景的多样性，各地BCG株的质量，及其它干扰免疫应答的诸多因素均对机体免疫应答产生影响，从而影响BCG的免疫效果，导致各人群的保护力不一致。综合文献，BCG的失效原因主要与以下四方面有关。

　　1.1 BCG缺乏重要保护性抗原

　　BCG缺乏一些结核杆菌的保护性抗原，例如引起抗结核病记忆免疫和保护性免疫的靶抗原ESAT-6在所有的BCG中缺乏；另一些保护性抗原在部分的BCG缺乏，如MPT64。由于这些保护性抗原的缺乏，个体产生的保护力有限。

　　这些抗原的缺失是BCG在实验室长期的传代培养，基因发生改变的结果，结核杆菌基因组测序的完成和基因比较学的发展为了解当代BCG的遗传基础和体外进化提供了重要支持。Behr等用全基因组微阵列作结核菌H37Rv株与牛分枝杆菌BCG株之间的平行比较杂交试验发现，现在使用的BCG基因有16个差别区RD1-RD16，共129个开放读码框缺失。有人推测其中的某些基因可能与细菌的毒力有关，也可能在BCG免疫失效中起着重要作用。Mahairas等发现编码结核杆菌ESAT-6分子的基因恰位于缺失的RD1基因差别区内（1C开放读码框），MPT64分子的编码基因位于RD2基因差别内（2G开放读码框）。

　　1.2　BCG不能有效刺激CD8+T细胞亚群

　　对结核病的免疫主要由细胞介导的免疫来完成,它包括CD4+T、CD8+T细胞和功能尚不十分明确CD1限制的aβT细胞和γδT细胞等多个T细胞亚群。CD4+T细胞亚群在结核病的免疫中发挥的重要作用已为人们共识，特别是艾滋病患者因CD4+T细胞受损，更易发生结核病。CD8+T细胞可通过多种机制在宿主防御结核杆菌感染和潜伏感染中发挥重要作用。BCG是一种强的CD4+T细胞型免疫应答诱导剂，但它是一种较弱的MHCI类限制性CD8+T细胞诱导激活剂，特别是对初始CD8+T细胞活化的能力值得怀疑，这可能是BCG的主要缺陷之一。研究表明，来自于BCG或者结核杆菌的抗原越容易进入宿主细胞胞浆，越容易刺激明显的MHC-Ⅰ限制性的CD8+T细胞免疫应答。而存在于吞噬细胞吞噬体内的BCG的抗原成分不易进入胞浆，故不能有效刺激CD8+T细胞。因此如何优化CD4+T细胞和CD8+T细胞免疫应答之间的平衡，有效刺激CD8+T细胞亚群是疫苗设计和改造必须考虑的。

　　1．3　环境分枝杆菌对BCG免疫的影响

　　存在于周围环境中的一些非致病性分枝杆菌（如鸟分枝杆菌、母牛分枝杆菌和瘰疠分枝杆菌等）对BCG免疫产生重要影响。在BCG接种试验中，大量的数据分析显示，研究地点的地理分布可以解释41%的BCG效力的异质性。在热带地区环境中分枝杆菌的流行率较高，BCG保护效力较低。相反，环境中分枝杆菌的流行率较低的地区，BCG的免疫保护力较高。关于这种干扰的确切机制尚不清楚，但有不同的解释。Hernandez-Pando等认为个体与高浓度的环境分枝杆菌接触后，可诱生Th2型细胞因子，改变了BCG接种后免疫应答的类型，从细胞免疫向体液免疫转变。Palmer和Long认为环境中分枝杆菌提供的微弱保护力掩了BCG的免疫效果。他们在研究中发现：如果将动物事先暴露在对结核感染有不同保护力的各种环境分枝杆菌条件下，再用BCG接种，则BCG接种后的免疫保护力将被掩盖。而这些环境中分枝杆菌提供的微弱的免疫保护力不足以抵抗结核杆菌的感染。Brandt等最近的研究展示：从这些环境分枝杆菌流行地区分离出的分枝杆菌样本，免疫小鼠并无保护效力。这种“致敏”可抑制BCG的最初生长繁殖，使BCG接种只产生短暂的免疫应答。但不足以抵御毒力更强的结核杆菌的攻击。环境分枝杆菌高度致敏后的个体接种BCG后免疫应答低下，而同一株BCG在环境分枝杆菌流行率低下地区未致敏的个体却能引起显著的免疫应答。

　　1．4　BCG接种后免疫记忆随时间消失

　　儿童对BCG接种会产生高水平的抗结核病免疫力，避免发生严重结核病。但进入青春期后，结核病发病率增高，BCG不再具有保护力。即使复种BCG，其保护力也未见明显增强。Brooks等对6-8周龄小鼠接种BCG，在3月龄、12月龄、16月龄和20月龄分别用相同量的结核杆菌毒力株气雾攻击，攻击后30天，处死动物，观察肺部情况来反映BCG的保护力。结果发现3月龄和12月龄鼠肺荷菌量减少10倍，能较好的抵抗毒力株攻击，而16周龄和20周龄的小鼠的抵抗力逐渐消失，保护力大幅下降。Sterne等在研究中发现BCG接种的个体在接种后两年内甚至十年内有保护力，但变化程度大，一旦超过十年，没有证据显示BCG还能提供保护力。一般认为，接种过BCG的个体在10-15岁后BCG发挥的保护力逐年下降，免疫记忆丧失。这是由于维持持续性免疫的CD4+记忆性T细胞随时间的延长而回复至幼稚表型，对这些已经回复的记忆细胞不能引起回忆反应，故不能有效控制结核杆菌感染。这种逐渐下降的免疫保护力和正在消失的免疫记忆可被一些分枝杆菌候选抗原增强恢复。由于大部分人群种了BCG，一个吸引人的策略为增强已经存在的免疫应答，使BCG的免疫保护力回升。

　　2 改造策略

　　2．1重组卡介苗（Rbcg）

　　将外源性基因导入BCGA构建成rBCG是BCG改造的重要方向之一。针对分枝杆菌感染性疾病的rBCG则主要从以下两种方法进行考虑。

　　一种方法是构建大量表达分枝杆菌自身保护性抗原的rBCG。通过BCG的生长繁殖，在体内表达这些分枝杆菌保护性抗原，从而更有效地激发机体免疫应答，增强BCG的免疫效果，得高保护力。在这方面，已有人作了一些研究。Horwitz等在BCG菌株中引入编码结核杆菌30Kda主要分泌型或细胞外蛋白（Ag85B）的质粒来观察rBCG的效力。发现rBCG均能稳定表达这种蛋白分子。与亲本BCG免疫的豚鼠相比，尽管体重变化不明显，但动物存活率和组织抑制细菌生长的能力均超过BCG。它是目前在保护力上超过现有BCG的唯一疫苗，已计划开始进行1期人体试验。Bao等构建了两株分别表达Hsp60-ESAT-6融合蛋白和ESAT-6分泌蛋白的rBCG。前者比BCG诱导更高滴度的特异性抗体和更强烈的细胞免疫应答，而后者的免疫原性与亲本BCG株相似；两株rBCG的毒力未见增强，都能明显抵御结核杆菌感染，但免疫保护效力方面，尚不能优于BCG。

　　另一种方法是构建能够改变吞噬细胞吞噬体膜通透性的rBCG。感染的结核杆菌或接种的BCG。感染的结核杆菌或接种的BCG持续存在于巨噬细胞吞噬体内，细胞抗原不容易进入胞浆，难以激发MHCⅠ类限制性CD8+T细胞的作用。通过引入表达李斯特菌溶素（Hly）的基因，使该rBCG表达Hly素，溶解吞噬体膜，改变其通透性，从而使BCG及其抗原成分从吞噬体空泡中释放，促进MHCⅠ类分子提呈抗原，激发CD8+T细胞活化。目前，Hess等已成功构建了能分泌生物学活性Hly的rBCG，能促进MHCⅠ类分子对可溶性蛋白的提呈。

　　2．2 BCG营养缺陷株、突变株

　　生物信息学和分子微生物学领域的发展，众多微生物基因组测序的完成，结合有关结核杆菌（MTB）和BCG基因组序列的资料，已使活的分枝杆菌株能合理减毒。一些研究者试图通过对分枝杆菌基因组已知功能基因的分析，运用基因敲除、定点突变、同源重组等分子生物学方法，实施特定基因的灭活得到性状改良的营养缺陷株、突变株。Jack-son等用基因定点同源重组的方法剔除BCG1173P2株营养缺陷型突变株，将其用作减毒活疫苗免疫豚鼠，发现在肺组织的免疫保护作用与BCG相同，但脾免疫保护作用尚不及BCG，值得进一步探讨。研究表明，免疫缺陷小鼠接种标准BCG疫苗后死亡，而接种营养缺陷型疫苗在HIV感染时将是安全的。Berthet等采用基因定点同源重组技术剔除BCG毒力相关基因erp，并检测了这种rBCG在培养的骨髓源性巨噬细胞中的增殖能力和在小鼠体内的增殖活性，发现这种突变株的繁殖力减弱。

　　2．3 促进T细胞亚群的免疫应答

　　新的疫苗设计应当考虑到细胞免疫的特点，充分发挥各T细胞亚群的作用，才能更有效防止结核病的发生理想的BCG应该同时具备激活CD4+亚群和激活CD8+亚群及其他亚群的能力。Freidag等用IL-12或含有胞嘧啶-磷酸鸟嘌呤（CpG）基序的寡脱氧核苷作为佐剂与BCG联合给药，免疫小鼠用Erdman株攻击，发现组织细菌数量减少、肉芽肿变小、IFN-γ产量增加，在小鼠模型中其保护性优于BCG单独免疫，但有增强毒力的可能。Hess构建的重组Hly能裂解吞噬体膜，使细菌逸入胞浆大量繁殖，增强经MHCⅠ类分子对抗原的呈递，选择性诱导细胞免疫应答，特别是CD8+T细胞介导的细胞免疫应答。

　　2．4 增强BCG免疫力的方法

　　增强BCG接种后，免疫保护力随时间延长而减弱，即使复种保护效力也未见增强，MHO在1995年已不再提倡复种。同时大部分人群已接种过BCG，可用一些增强剂或者“初免——加强”方法增强已经存在的免疫力。

　　Brooks等发现Ag85A亚单位疫苗是一种成功的免疫增强剂，它能使BCG接种后正在减弱的免疫应答得以增强。小鼠接种BCG后，分别用纯化滤液蛋白Ag85A增强两次，再用结核杆菌毒力株H37RV功击，结果发现肺部细菌载荷量比对照组大大降低，保护力增强，明显优于使用Ag85A单独免疫机体所获得的免疫效力。另外，这种亚单位疫苗的增强用不受环境分枝杆菌影响。

　　“初免——加强”方法是连续给予载体不同得表达抗原相同的两种疫苗，通过全面激发机体免疫应答来提高免疫力的一种方法。相对于传统的“同源加强”（由相同释放系统接种每剂抗原）这种方法称为“异源加强”。其理论基础是用抗原或表达抗原的DNA初次免疫激发机体的细胞免疫应答，特别是Thl型细胞免疫应答，然后使用强表达系统的抗原来增强这种Thl型细胞免疫应答，从而提高免疫力，Mcshame等正在研究用BCG初免后，用表达Ag85A的重组痘苗病毒株MVA和FP9株加强免疫，而观察其免疫效果。另一些研究者则先用DNA疫苗初免，再用BCG免疫进一步增强BCG的保护力。Feng等对C57BL/6小鼠用DNA-85B初免，6周后再用BCG加强免疫，隔6周后用结核杆菌毒力株气雾攻击，四周后收集肺、脾和血液进行活菌计数（CFU）。结果脾中细菌负荷降低100倍，与BCG单独免疫相比，细胞数减少10倍。Skinner等认为联合几种DNA疫苗初免后再用BCG加强有更好地效果。他们用编码HSP65、HSP70和Apa抗原的DNA疫苗联合初免被环境分枝杆菌致敏的牛，然后用BCG加强免疫，观察用牛型结核杆菌毒力株攻击后病变的程度和淋巴结的细菌数量变化。结果发现初免加强实验组能诱导高水平的抗原特异性的γ干扰素（IFN-γ），出现严重肺部损害的牛数量减少，每只牛的淋巴结损害减轻，咽后淋巴结和胸部淋巴结中的细菌数量减少。它提供的保护性比单独用BCG免疫提供的保护性明显增强。

　　3 展望

　　尽管BCG免疫保护效果不稳定，但它仍是目前预防结核病的应用最主的唯一疫苗。虽然有许多新型结核病防治疫苗在动物试验中显示出良好的保护效果，但它们的免疫效果尚不能超越BCG，如DNA疫苗、亚单位疫苗等。基于生物技术的发展，改造卡介苗、增强BCG的效力已成为可能，相信新型BCG将为结核病及其他传染病的防治发挥更大的作用。

　　何永林综述 朱道银审校

　　来源：《国外医学预防诊断治疗用生物制品分册》2004年2月 第27卷 第1期